[發明專利]結構化肽加工

有效

• 申請號: 201080015779.4
• 申請日: 2010-02-04
• 公開（公告）號: CN102405059B
• 公開（公告）日: 2016-10-12
• 發明（設計）人: G.P.溫特;C·黑尼斯;E·貝納;D·羅亞克斯;M·維斯伯德
• 申請（專利權）人: 自行車治療有限公司
• 主分類號: A61K47/48
• 分類號: A61K47/48;G01N33/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李進;林毅斌

本發明涉及肽的加工，所述肽的結構因與化合物結合而受約束，所述化合物提供結構骨架，賦予所述肽構象。具體而言，本發明涉及這類肽的蛋白水解處理，以選擇蛋白酶抗性肽或者選擇所產生的切割產物。

介紹

對生物靶標有高親和力和特異性的分子的制備是化學、生物和制藥科學的中心問題。具體而言，結合配體對于可干預生物過程的藥物的制備是重要的。與所選靶配體結合的配體的制備通常包括產生眾多推定的結合分子和檢測所述分子的結合性能的過程。

合成的分子結構所束縛的多肽在本領域中已知(Kemp，D.S.和McNamara，P.E.，J.Org.Chem，1985；Timmerman，P.等人，ChemBioChem，2005)。Meloen和同事們曾使用三(溴甲基)苯和相關分子進行將多個肽環快速和定量環化至合成支架上，以用于蛋白質表面的結構模擬(Timmerman，P.等人，ChemBioChem，2005)。制備候選藥物化合物的方法在WO?2004/077062和WO?2006/078161中公開，其中通過將含半胱氨酸的多肽連接到分子支架(如例如三(溴甲基)苯)來制備所述化合物。

WO2004/077062公開了選擇候選藥物化合物的方法。具體而言，此文件公開了包含第一和第二活性基團的各種支架分子，并在偶聯反應中用另一種分子接觸所述支架以在所述支架和所述另一種分子之間形成至少兩個鍵。

WO2006/078161公開了結合化合物、免疫原性化合物和肽模擬物。此文件公開了從現有的蛋白質中獲得的肽的各個集合的人工合成。然后將這些肽與具有為了制備組合文庫而引入的一些氨基酸變化的固定合成肽結合。通過經由化學鍵引入此多樣性來分離以各種氨基酸變化為特征的肽，使獲得所需結合活性的機會增加。此文件的圖7顯示各種環肽構建體的合成示意圖。然而，所產生的肽有單特異性。在提供多個肽環的位置，所述環協同結合到單一靶標。

在我們共同待審的國際專利申請WO2009098450中，我們公開了將生物選擇技術例如噬菌體展示用于選擇合成的分子結構所束縛的肽。

在本領域中已知修飾多肽(包括多肽庫)的蛋白水解處理的應用。例如，GB2428293(Domantis?Limited)描述了以下方法，其通過用蛋白酶處理噬菌體來還原噬菌體上所展示肽的化合價，使得大多數噬菌體不展示肽和一部分是單價的。

基于噬菌體展示蛋白對蛋白水解降解的抗性而從該蛋白庫中選擇穩定折疊的蛋白質的策略，已用于改善天然蛋白質的穩定性。蛋白水解的降解通常限制于解折疊的蛋白質或折疊蛋白質的高度柔性區域。折疊的蛋白質大部分是蛋白酶抗性的，因為蛋白水解切割要求多肽鏈呈蛋白酶活性位點的特定立體化學，從而使蛋白酶活性位點有柔性、可接近和能夠局部解折疊。

此外，本領域中已將蛋白酶用于制備所需切割產物，例如在Fc、Fab和Fv抗體片段的制備中。

我們發現，蛋白酶消化技術可適于修飾合成分子支架所束縛的結構化多肽，無論其是否在噬菌體上展示。這些技術不僅使蛋白酶抗性結構化肽的制備而且使蛋白酶切割產物的制備成為可能，在上述蛋白酶切割產物中大多數多肽仍然束縛于支架。

發明概述

在第一個實施方案中，提供制備一種或多種肽配體的方法，所述肽配體包含在兩個或更多個氨基酸殘基上與分子支架共價連接的多肽，所述方法包括以下步驟：

(a)在遺傳展示系統中展示一種或多種肽配體，其中所述多肽包含兩個或更多個與分子支架形成共價鍵的活性基團和至少一個環，所述環包含位于(subtend)兩個所述活性基團之間的兩個或更多個氨基酸的序列；

(b)將所述肽配體暴露于一種或多種蛋白酶；和

(c)針對靶標結合篩選所述肽配體，和選擇與所述靶標結合的配體。

在相關的實施方案中，本發明提供制備一種或多種肽配體的方法，所述肽配體包含在兩個或更多個氨基酸殘基上與分子支架共價連接的多肽，所述方法包括以下步驟：

(a)在遺傳展示系統中展示一種或多種肽配體，其中所述多肽包含兩個或更多個與分子支架形成共價鍵的活性基團和至少一個環，所述環包含位于兩個所述活性基團之間的兩個或更多個氨基酸的序列；

(b)針對靶標結合篩選所述肽配體，和選擇與所述靶標結合的配體；

(c)將與所述靶標結合的肽配體暴露于一種或多種蛋白酶；和

(d)針對靶標結合進一步篩選所述肽配體。