[發明專利]在梭菌中的雙交換同源重組的方法

無效

• 申請號: 201080013200.0
• 申請日: 2010-01-21
• 公開（公告）號: CN102361986A
• 公開（公告）日: 2012-02-22
• 發明（設計）人: 斯蒂芬·托馬斯·卡特曼;納杰爾·彼得·明頓
• 申請（專利權）人: 諾丁漢大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/90
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務所(普通合伙) 31218
• 代理人: 陳酩;翟羽

1.一種在宿主梭菌細胞中雙交換同源重組的方法，包含：

供體DNA分子和該宿主細胞的DNA之間的第一同源重組活動，從而在該宿 主細胞中形成該第一重組活動的產物，其中該供體DNA分子包含codA基因和至 少兩個同源臂；以及

在該第一同源重組活動的產物內的第二重組活動，借以在宿主細胞中形成可 通過該codA基因的丟失而可選擇的該第二同源重組活動的產物。

2.如權利要求1所述的方法，其中該宿主細胞的DNA包含該宿主細胞的染色體 或質粒。

3.如權利要求1或權利要求2所述的方法，其中該供體DNA分子進一步包含可 選擇的等位基因。

4.如任一前述權利要求所述的方法，其中該codA基因是負性篩選標記。

5.如權利要求1至3中任一權利要求所述的方法，其中該codA基因是正性篩選 標記。

6.如任一前述權利要求所述的方法，其中該供體DNA分子在該宿主細胞中不被 有效地復制。

7.如任一前述權利要求中所述的方法，進一步包含選擇該第一同源重組活動的產 物的步驟。

8.如任一前述權利要求中所述的方法，進一步包含選擇該第二同源重組活動的產 物的步驟。

9.如任一前述權利要求所述的方法，其中該供體DNA分子進一步包含在該第一 同源重組活動中被引入至該宿主DNA的替代的等位基因。

10.如權利要求9所述的方法，其中該替代的等位基因在該第二同源重組活動之 后被保留在該宿主DNA中。

11.如任一前述權利要求所述的方法，其中該供體DNA分子包含至少兩個同源 臂。

12.如任一前述權利要求所述的方法，其中該供體DNA分子是質粒。

13.如權利要求12所述的方法，其中該質粒是非復制質粒、復制缺陷質粒或條件 質粒。

14.如任一前述權利要求所述的方法，其中該梭菌細胞是梭菌屬或熱厭氧桿菌屬 的物種。

15.如任一前述權利要求所述的方法，其中該方法進一步包含在該第一同源重組 活動之前以供體DNA分子轉化宿主梭菌細胞的步驟。

16.如任一前述權利要求所述的方法，其中該方法進一步包含通過由于該codA基 因丟失而得的表型改變來分離該宿主細胞的步驟，該宿主細胞包含該第二同源重組活 動的產物。

17.如任一前述權利要求所述的方法，其中該供體DNA分子包含多核苷酸序列， 其選自任何包含SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4和SEQ?ID?NO：5的群 組。

18.一種生成已變更的宿主細胞的方法，包含提供宿主細胞和實施任一前述權利 要求所述的方法。

19.已變更的宿主細胞，其由任一前述權利要求所述的方法得到。

20.載體，其包含該codA基因和至少兩個用于轉化梭菌細胞的同源臂。

21.載體，其包含選自SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4和SEQ?ID?NO： 5中任何的序列。