[發(fā)明專(zhuān)利]全部流感嗜血桿菌的測(cè)定方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201080003186.6
• 申請(qǐng)日: 2010-01-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102216781A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-10-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 增田尚代;石川優(yōu)一;佐藤亞友美;田中秀明
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 大塚制藥株式會(huì)社
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/569
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 苗堃;金世煜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及特異性地測(cè)定所有流感嗜血桿菌的方法、以及用于該方法的測(cè)定裝置。

背景技術(shù)

已知流感嗜血桿菌(HaemoPhilus?influenzae)與肺炎球菌同樣作為人鼻咽腔的常居菌，并已知對(duì)于沒(méi)有達(dá)到常居化的、尤其是嬰幼兒、小兒而言是呼吸道感染、中耳炎、髓膜炎、敗血癥等的病原菌。與其它感染疾病的病原菌同樣，對(duì)于流感嗜血桿菌而言，多用抗菌藥導(dǎo)致的耐藥性作為導(dǎo)致癥狀的難治、重癥化的原因而成為問(wèn)題，治療開(kāi)始時(shí)的適當(dāng)?shù)目咕庍x擇的重要性正在增加。作為感染疾病治療的原則，盡可能早期確定病原菌，并選擇確切的治療對(duì)預(yù)后的改善、醫(yī)療成本的削減、防止出現(xiàn)耐藥菌很重要，因此需要迅速檢測(cè)來(lái)自流感嗜血桿菌的共同抗原的診斷試劑。

現(xiàn)在，作為流感嗜血桿菌判定方法使用革蘭氏染色法、鏡檢、培養(yǎng)法、利用菌體的酶代謝的顯色反應(yīng)、乳膠凝集法、PCR法等。其中，作為迅速診斷方法有利用乳膠凝集法的流感嗜血桿菌抗原檢測(cè)試劑盒(Slidex?Meningite-Kit?5.bioMerieux公司)，但這是檢測(cè)b型流感嗜血桿菌的多糖體抗原的方法，不能用于無(wú)莢膜型的判定。另外，也有采用PCR法的流感嗜血桿菌基因檢測(cè)測(cè)定法、以菌株共同抗原的P6、P4抗原作為靶的這些基因檢測(cè)測(cè)定法，但采用PCR法的基因診斷測(cè)定法由于實(shí)施設(shè)備受限而目前缺乏普遍性。另外，有關(guān)于P6抗原的單克隆抗體的報(bào)告，是通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)流感嗜血桿菌(非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。但是，采用該方法的靈敏度低，不是作為臨床檢查使用的水平。

流感嗜血桿菌是革蘭氏陰性桿菌，根據(jù)覆蓋菌的莢膜的有無(wú)大致分為莢膜型和無(wú)莢膜型，進(jìn)一步按照存在于莢膜的多糖抗原的結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致的血清類(lèi)型分類(lèi)，莢膜型存在a～f型，另外，無(wú)莢膜型被分類(lèi)為不能區(qū)分類(lèi)型的型。作為b型莢膜多糖的多核糖基核糖醇磷酸鹽被報(bào)告是b型特異性抗原，但是在無(wú)莢膜型中還沒(méi)發(fā)現(xiàn)作為這樣的特異抗原的多糖。另外，作為無(wú)莢膜型的蛋白抗原已知作為流感嗜血桿菌的主要抗原的、菌體外膜蛋白質(zhì)之一的P2蛋白質(zhì)，由于本抗原多發(fā)變異，已知根據(jù)菌株而抗原性不同。

非專(zhuān)利文獻(xiàn)

非專(zhuān)利文獻(xiàn)1：Journal?of?Clinical?Microbiology.(1989)2263-2267

發(fā)明內(nèi)容

如上所述，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌的共同抗原，沒(méi)有能夠同時(shí)檢測(cè)全部流感嗜血桿菌的免疫學(xué)的方法。

本發(fā)明的課題是解決上述問(wèn)題，將提供能夠以高靈敏度同時(shí)檢測(cè)全部的流感嗜血桿菌的免疫學(xué)測(cè)定方法、以及利用該方法的測(cè)定裝置作為課題。

本發(fā)明的發(fā)明人，為了解決上述課題而進(jìn)行深入研究的結(jié)果，關(guān)注了以往被認(rèn)為流感嗜血桿菌中共同存在并且變異比較少的P4和P6蛋白。該蛋白質(zhì)相比于其它抗原在流感嗜血桿菌中表達(dá)量少，因而認(rèn)為即使制作了識(shí)別抗體也難以高靈敏度地、且全面性地測(cè)定全部類(lèi)型的流感嗜血桿菌。另外，存在很多具有與P4和P6蛋白同源性高的蛋白的細(xì)菌，因此認(rèn)為難以特異性地檢測(cè)流感嗜血桿菌。但是，與預(yù)想相反，本發(fā)明的發(fā)明人能夠制作高選擇性地進(jìn)行識(shí)別的抗體。另外，確認(rèn)了該抗體很難受到具有測(cè)定時(shí)容易混入的可能性的綠膿桿菌、大腸桿菌等的影響。本發(fā)明是基于本成果而完成的發(fā)明。

即，本發(fā)明提供一種全部流感嗜血桿菌的免疫學(xué)測(cè)定方法，其特征在于，使用流感嗜血桿菌的P4抗原識(shí)別抗體或P6抗原識(shí)別抗體。

另外本發(fā)明還提供一種全部流感嗜血桿菌的免疫學(xué)測(cè)定裝置，其特征在于，含有流感嗜血桿菌的P4抗原識(shí)別抗體或P6抗原識(shí)別抗體。

根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)以所有流感嗜血桿菌為對(duì)象的高靈敏度測(cè)定方法的確立，使該測(cè)定裝置的提供成為可能，由此使得在中耳炎等中感染的所有流感嗜血桿菌的檢測(cè)能夠簡(jiǎn)便、迅速地進(jìn)行。本發(fā)明方法對(duì)由流感嗜血桿菌導(dǎo)致的中耳炎的檢測(cè)特別有用。

附圖說(shuō)明

圖1表示ELISA中的、對(duì)于抗P4PoAb(a)和抗P6PoAb(b)的免疫原的流感嗜血桿菌共同抗原(P6、P4)的反應(yīng)性。

圖2表示ELISA中的、對(duì)于抗P6PoAb的NTHiP6(a)和NTHi破碎菌體(b)的反應(yīng)性。

圖3表示ELISA中的、對(duì)于抗P6PoAb的細(xì)菌類(lèi)(表1)的反應(yīng)性。

圖4表示ELISA中的、對(duì)于抗P4PoAb的P4rec.(a)和NTHi菌體提取液(b)的反應(yīng)性。

圖5表示ELISA中的、對(duì)于抗P4PoAb的細(xì)菌類(lèi)(表1)的反應(yīng)性。

圖6表示免疫層析的一般性結(jié)構(gòu)。

圖7表示免疫層析停止時(shí)的檢測(cè)體的展開(kāi)狀態(tài)。