[發(fā)明專利]一種水果或蔬菜上洋蔥伯克氏菌群的檢測(cè)及種的鑒定方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201019146004.X
• 申請(qǐng)日: 2010-02-04
• 公開（公告）號(hào): CN101838705A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方媛;謝關(guān)林;樓妙苗;朱勃;李斌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12R1/01
• 代理公司: 杭州天勤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種水果或蔬菜上洋蔥伯克氏菌群的檢測(cè)及種的鑒定方法。

背景技術(shù)

洋蔥伯克氏菌群(Burkholderia?cepacia?complex，Bcc)是一類廣泛存在于土壤、水、植物表面和醫(yī)院環(huán)境的革蘭氏陰性細(xì)菌，同時(shí)也是一類表型相似而基因型不同的細(xì)菌菌群，由17個(gè)種組成，分別為B.cepacia，Burkholderia?multivorans，Burkholderia?cenocepacia，Burkholderiastabilis，Burkholderia?vietnamiensis，Burkholderia?dolosa，Burkholderiaambifaria，Burkholderia?anthina，Burkholderia?pyrrocinia，Burkholderiaubonensis，Burkholderia?lateens，Burkholderia?diffusa，Burkholderiaarboris，Burkholderia?seminalis，Burkholderia?metallica，Burkholderiacontaminans和Burkholderia?lata。該菌最初在洋蔥上發(fā)現(xiàn)能引起洋蔥酸皮病，自上個(gè)世紀(jì)80年代以來，該菌作為人體條件致病菌被廣泛報(bào)道，能導(dǎo)致免疫力低下的病人感染發(fā)病，尤其能引起囊性肺纖維化(CF)患者死亡。隨后，該菌又被報(bào)道能引起各種蔬菜和水果的病害，如生菜的腐爛，香蕉的果指尖腐病，杏果腐病等，因此，Bcc在蔬菜和水果上的存在引起了廣泛關(guān)注。

據(jù)研究，Bcc的不同種對(duì)人體的危險(xiǎn)性不同，引起CF病人感染的Bcc菌中，90％為Burkholderia?multivorans和Burkholderia?cenocepacia兩個(gè)種。因此，除了檢測(cè)蔬菜和水果上是否存在Bcc外，種的鑒定也很關(guān)鍵。傳統(tǒng)檢測(cè)和鑒定采用病原菌分離、革蘭氏染色、生理生化反應(yīng)特性測(cè)定、BIOLOG、脂肪酸等鑒定方法，周期長(zhǎng)，過程繁瑣，且檢測(cè)結(jié)果不一定可靠，不僅不能將Bcc菌與一些相近屬種區(qū)分開來，更加難以區(qū)分Bcc的各個(gè)種。PCR技術(shù)作為一種現(xiàn)在流行的病原檢測(cè)和鑒定手段，可有效地對(duì)這一復(fù)雜的菌群進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種蔬菜或水果上洋蔥伯克氏菌群的檢測(cè)和種的鑒定方法，解決了傳統(tǒng)方法周期長(zhǎng)，過程繁瑣，檢測(cè)結(jié)果不可靠的問題。

一種水果或蔬菜上洋蔥伯克氏菌群(Burkholderia?cepacia?complex，Bcc)的檢測(cè)及種的鑒定方法，包括以下步驟：

(1)取有腐爛癥狀的蔬菜或水果的病健交界處組織，在無菌水中搗碎后，涂布于PCAT平板上，培養(yǎng)后挑取乳白色的單菌落，純化后提取菌株的DNA；

(2)以每個(gè)菌株的DNA為模板，利用引物BCR1和引物BCR2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離后用指示劑顯色，假如凝膠呈現(xiàn)1043bp的條帶，說明該菌株屬于洋蔥伯克氏菌群；

(3)用內(nèi)切酶HaeIII對(duì)經(jīng)鑒定屬于洋蔥伯克氏菌群的菌株的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，獲得限制性酶切圖譜，初步確定菌株的種；

(4)以初步確定種的菌株的DNA為模板，利用相應(yīng)種的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離后用指示劑顯色，假如凝膠呈現(xiàn)條帶，則確定該菌株的種與初步確定的種一致；

(5)假如凝膠未呈現(xiàn)條帶，則對(duì)該菌株步驟(2)中的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到其recA序列，構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，確定該菌株的種。

優(yōu)選地，所述的步驟(1)提取菌株DNA的方法如下：

將菌體置于細(xì)胞裂解液中，于92～97℃加熱10～20min，用雙蒸水或TE稀釋，所述的細(xì)胞裂解液包括重量百分比為0.25％的SDS和0.05mol/LNaOH，利用該裂解液提取DNA操作方便，省時(shí)。

優(yōu)選地，所述的步驟(2)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：

94℃預(yù)變性3min后94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。

優(yōu)選地，所述的步驟(3)中15μl酶切體系包括：

PCR產(chǎn)物????????10μL

10×buffer?????1.5μL

HaeIII內(nèi)切酶???1μL

ddH₂O??????????2.5μL。