[發(fā)明專利]雞α干擾素/白細胞介素2嵌合基因

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201019097009.8
• 申請日: 2010-02-08
• 公開（公告）號: CN102041263A
• 公開（公告）日: 2011-05-04
• 發(fā)明（設計）人: 吳志明;閆若潛;張志凌;張健;謝彩華;劉光輝;張盼盼;盛敏;劉梅芬;荊汝頂;王東方;錢勇;程俊貞;李桂喜;劉先敏;安春霞;孫清蓮
• 申請（專利權(quán)）人: 河南省動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/11;C12N15/70;C07K19/00;A61K38/21;A61P31/12;A61K38/20
• 代理公司: 鄭州聯(lián)科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 時立新

技術領域

本發(fā)明屬于生物基因工程技術領域，涉及雞α干擾素與白細胞介素2嵌合基因及其構(gòu)建、融合表達和純化技術。

背景技術

我國是世界上養(yǎng)雞大國，雞的疾病種類繁多，特別是病毒性傳染病造成的發(fā)病率和死亡率最高，每年給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，而且有些病毒性疾病(如高致病性禽流感等)還關系到人類自身的健康。因此對這些病毒性疾病的治療和預防成為養(yǎng)雞業(yè)的首要任務。

目前，尚無特效藥物可以治療病毒性疾病，盡管一些化學合成的抗病毒藥物如鹽酸金剛烷胺、利巴偉林等對少數(shù)病毒病有一定的作用，但由于這些藥物在人醫(yī)上也廣泛應用，為防止藥物殘留及耐藥菌株的產(chǎn)生，目前已禁止在獸醫(yī)臨床上應用；因此對病毒病的防控主要靠疫苗免疫接種進行預防。但是由于病毒血清型眾多，毒株基因變異速度快，常常導致疫苗免疫失敗；另外，新的病毒病也可能不斷產(chǎn)生，某些病毒病目前仍無疫苗可用；這些因素往往造成病毒性傳染病流行趨勢擴大。

干擾素(interferon，IFN)是一類在同種細胞上具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫激活功能活性的細胞因子，其抗病毒活性具有種屬特異性，其活性的發(fā)揮受細胞基因組的調(diào)節(jié)與控制，并涉及RNA和蛋白質(zhì)的合成。干擾素分為I型和II型兩大類，II型干擾素只有IFN-γ，其主要作用是免疫調(diào)節(jié)作用；I型干擾素分為五個亞型種類，其中α干擾素(IFN-α)主要由單核吞噬細胞、B細胞和成纖維細胞合成，是干擾素中最大的一個基因家族。機體內(nèi)產(chǎn)生的IFN-α是病毒誘導白細胞產(chǎn)生的，其主要作用有以下幾個方面：①IFN-α通過誘導機體產(chǎn)生抗病毒蛋白而發(fā)揮廣譜的抑制病毒繁殖活性；②抑制細胞的增殖(如腫瘤細胞等)從而發(fā)揮抗腫瘤活性作用；③加強NK細胞殺傷病毒感染細胞的能力從而抑制病毒的增殖和擴散；④增強MHC?I類抗原表達；調(diào)節(jié)T、B細胞功能以及許多免疫反應，特別是增強機體細胞免疫應答水平。

白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)又稱T細胞生長因子，能誘導T淋巴細胞增殖，增強細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的活性，刺激細胞分泌腫瘤壞死因子(TNF-α)、IFN-γ等細胞因子，促進機體的細胞免疫能力；同時也能激活B淋巴細胞，參與機體的體液免疫應答，促進抗體分泌；IL-2還可增強巨噬細胞對抗原遞呈能力、殺菌力及細胞毒性，從而發(fā)揮其抗病毒和抗腫瘤作用。因而，基因工程重組IL-2蛋白(rIL-2)制劑不僅可作為抗病毒性疾病、自身免疫病與防治腫瘤方面的治療藥劑，而且還可作為佐劑增強疫苗的免疫效果，具有廣闊的應用前景。

正常情況下，IFN-α、IL-2等細胞因子在動物體內(nèi)的表達量較低且難以提取應用，已有的采用體外抗原刺激動物白細胞使其產(chǎn)生IFN-α的方法得到的產(chǎn)品產(chǎn)量和活性都低，且生產(chǎn)成本較高。基因工程α干擾素及IL-2具有廣譜的抗病毒活性和增強疫苗免疫力作用，對細胞內(nèi)寄生菌和寄生蟲等的增殖和活性也有一定的作用，而且不會產(chǎn)生耐藥性和殘留，不會對人類健康造成危害，因此一直是研究抗病毒制劑關注的焦點。rChIFN-α蛋白對NDV、馬立克氏病毒及禽流感H9N2型病毒具有抑制作用，rChIL-2蛋白可調(diào)節(jié)機體免疫功能，增強疫苗的免疫效果，并能明顯提高雞胚對IBDV、IBV強毒株攻毒的保護力。由于IFN-α和IL-2都具有廣譜的抗病毒活性，因此將二者聯(lián)合應用可發(fā)揮更強的抗病毒作用，可以對雞的病毒性疾病能起到很好的預防作用，目前尚未見此方面的相關報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種雞α干擾素/白細胞介素2嵌合基因構(gòu)建、表達及其蛋白純化方法，目的在于提供雞α干擾素/白細胞介素2嵌合基因，以得到抗病毒譜廣、抗病毒活性高、生產(chǎn)成本低、易于生產(chǎn)、無殘留、不會使病原體產(chǎn)生耐藥性、具有ChIFN-α和ChIL-2抗病毒功能疊加的高效基因工程復合抗病毒制劑，用于雞病毒性疾病的防治。

為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本研究采用重疊延伸PCR(splicing?by?overlap?extension-PCR，SOE-PCR)方法將ChIFN-α和ChIL-2成熟肽基因通過一個基因柔性接頭(linker)(G₄S)₃構(gòu)建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因，將嵌合基因連接入pQE30原核表達載體進行融合表達，采用尿素溶解-低濃度蛋白復性液復性-PBS透析方法對融合蛋白進行復性和純化，對純化后的融合蛋白進行細胞上和雞體內(nèi)活性測定。

主要內(nèi)容如下：

1、雞α干擾素/白細胞介素2嵌合基因，其構(gòu)建、表達及其蛋白純化

1.1?引物序列