[發(fā)明專利]一種人41型腺病毒(Ad41)包裝細(xì)胞株及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010622987.2
• 申請(qǐng)日: 2010-12-28
• 公開（公告）號(hào): CN102533657A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魯茁壯;洪濤;王敏;鄒小輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/85;C12N7/01;C12R1/91
• 代理公司: 北京北翔知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11285
• 代理人: 張廣育;姜建成

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因治療和重組疫苗領(lǐng)域中一種腺病毒Ad41的包裝細(xì)胞及其應(yīng)用。?

背景技術(shù)

腸道作為基因治療的靶器官有諸多優(yōu)點(diǎn)：(a)給藥方式簡(jiǎn)便，可以直接口服給藥或選擇內(nèi)窺鏡給藥；(b)腸道上皮的表面積大，便于載體的充分吸附和感染；(c)腸道上皮的隱窩細(xì)胞是干細(xì)胞，對(duì)其的感染能延長目的基因的表達(dá)時(shí)間(Croyle?MA，Stone?M，Amidon?GL，Roessler?BJ.In?vitro?and?in?vivo?assessment?of?adenovirus41?as?a?vector?for?gene?delivery?to?the?intestine.Gene?Ther，1998，5(5)：645-654.[pubmed：9797869])。粘膜是多數(shù)病原微生物入侵機(jī)體的第一道屏障，口服給藥的疫苗能激發(fā)粘膜免疫和系統(tǒng)免疫，是今后疫苗研究的重要方向。?

腺病毒載體(Adenovector，Ad)由于具有遺傳穩(wěn)定、感染細(xì)胞效率高、不整合入細(xì)胞基因組(安全性好)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于基因治療和重組疫苗研究。人F組腺病毒包括Ad40和Ad41兩個(gè)成員，能引起嬰幼兒急性胃腸炎，是天然的腸道病原，被稱為腸腺病毒(entericadenovirus)(Tiemessen?CT，Kidd?AH.The?subgroup?F?adenoviruses.J?Gen?Virol，1995，76(Pt?3)：481-497.[pubmed：7897343])。研究表明Ad41對(duì)胃酸和腸消化液有很強(qiáng)的耐受性，對(duì)分化的腸上皮細(xì)胞感染能力強(qiáng)，是理想的用于腸道給藥的基因治療載體(Favier?AL，Burmeister?WP，Chroboczek?J.Unique?physicochemical?properties?ofhuman?enteric?Ad41?responsible?for?its?survival?and?replication?in?thegastrointestinal?tract.Virology，2004，322(1)：93-104.[pubmed：15063120])。?

前期研究中，發(fā)明人從嬰幼兒腹瀉標(biāo)本中分離到一株野生型?Ad41病毒，以其基因組DNA為基礎(chǔ)，構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒pSh41-CMV和骨架質(zhì)粒pAdbone41。利用這2個(gè)質(zhì)粒，能夠構(gòu)建攜帶目的基因的重組Ad41質(zhì)粒，腺病毒質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶PmeI線性化后，轉(zhuǎn)染293E12包裝細(xì)胞，能夠拯救和擴(kuò)增重組Ad41病毒。但293E12的病毒包裝能力較弱，重組病毒需要擴(kuò)增10-12代，病毒產(chǎn)量才能達(dá)到10¹²顆粒(viral?particles，vp)(Lu?ZZ，Zou?XH，Dong?LX，Qu?JG，Song?JD，Wang?M，Guo?L，Hung?T.Novel?recombinant?adenovirus?type?41vector?and?its?biological?properties.J?Gene?Med，2009，11(2)：128-138.[pubmed：19097028])。?

293細(xì)胞是腺病毒Ad5E1區(qū)轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞，組成型表達(dá)Ad5E1基因(包括E1A，E1B19K和E1B55K)。腺病毒E1B55K蛋白具有型特異性，Ad5的E1B55K不能完全替代Ad41E1B55K的生物功能，野生型Ad41在293細(xì)胞復(fù)制困難，E1區(qū)缺失的重組Ad41載體無法在293細(xì)胞拯救和包裝。?