[發(fā)明專(zhuān)利]一種液滴陣列PCR芯片及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010620364.1
• 申請(qǐng)日: 2010-12-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102168011A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-08-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚波;方群;張?jiān)葡?/a>;祝瑩
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12M1/00
• 分類(lèi)號(hào): C12M1/00;C12M1/34;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 杭州天正專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

一、技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種實(shí)時(shí)定量PCR芯片及其熒光檢測(cè)系統(tǒng)，特別是涉及一種基于液滴陣列的PCR芯片和熒光成像檢測(cè)系統(tǒng)。

二、背景技術(shù)：

實(shí)時(shí)定量(反轉(zhuǎn)錄)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)qPCR或qRT-PCR)技術(shù)是以傳統(tǒng)PCR技術(shù)為基礎(chǔ)建立起來(lái)的一種可對(duì)原始核酸(包括DNA和RNA)模板拷貝數(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析的一種現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。由于qPCR技術(shù)具有準(zhǔn)確度高，線(xiàn)性范圍寬等優(yōu)勢(shì)，因此，已經(jīng)廣泛地用于分子診斷，疾病研究，臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。qPCR技術(shù)通常遵循傳統(tǒng)PCR的擴(kuò)增原理，不同的是在每一個(gè)循環(huán)的退火或延伸階段進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，而溶液中模板的原始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)與檢測(cè)閾值(Ct)存在線(xiàn)性關(guān)系。

在過(guò)去的十幾年間，傳統(tǒng)儀器的微型化和便攜化已經(jīng)成為生物、化學(xué)及醫(yī)藥行業(yè)的一個(gè)重要的發(fā)展方向，其中，微型化的傳統(tǒng)PCR裝置已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)之一，尤其是微型化的qPCR技術(shù)由于其具有低成本，高靈敏度和高通量的，有希望成為大規(guī)模基因表達(dá)分析和藥物篩選領(lǐng)域的重要工具平臺(tái)而逐漸成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。最近，Hua等[Zhishan?Hua，Jeremy?L.Rouse，Allen?E.Eckhardt，VijaySrinivasan，Vamsee?K.Pamula，Wiley?A.Schell，Jonathan?L.Benton，Thomas?G.Mitchell，§and?Michael?G.Pollack，Multiplexed?Real-Time?Polymerase?ChainReaction?on?a?Digital?Microfluidic?Platform?Anal.Chem.2010，82，2310-2316]提出了一種基于電潤(rùn)濕驅(qū)動(dòng)的數(shù)字微流控qPCR系統(tǒng)，包裹著不同模板分子的液滴在四個(gè)平行環(huán)形通道中分別經(jīng)過(guò)不同溫區(qū)，進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。該系統(tǒng)的缺點(diǎn)是通量太低，而且每條環(huán)形通道都必須配備一套熒光檢測(cè)系統(tǒng)，過(guò)于復(fù)雜。

國(guó)外一些公司也開(kāi)發(fā)了一些微型化PCR產(chǎn)品，例如，STMicroelectronics的In-Check^TM系統(tǒng)和美國(guó)佳能生命科學(xué)的數(shù)字多重PCR芯片[I.T.奈特，井上裕司，用于數(shù)字多重PCR測(cè)定的裝置和方法，公開(kāi)號(hào)CN?101583724A，]。兩種產(chǎn)品都是基于微流控芯片技術(shù)，In-Check^TM芯片是在進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，將產(chǎn)物與微陣列芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，采用端點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行分析的一種技術(shù)。而后者是將芯片得到的PCR產(chǎn)物做溶解度曲線(xiàn)分析，通過(guò)熒光強(qiáng)度不同輸出0或1信號(hào)作為陰性或陽(yáng)性的閾值，進(jìn)行SNP分析。另一些公司很早就將研究重點(diǎn)放在了qPCR技術(shù)上，其中，比較典型的例子是美國(guó)ABI公司的芯片和Fluidigm的BioMark^TM微流控?cái)?shù)字PCR芯片系統(tǒng)。芯片是在不銹鋼材料上加工出三千個(gè)納升級(jí)孔陣列，并采用化學(xué)修飾技術(shù)將孔內(nèi)外表面進(jìn)行不同處理，以每個(gè)納米孔位基本單位，進(jìn)行平行qPCR檢測(cè)分析。該芯片的缺點(diǎn)是加工工藝比較復(fù)雜，成本較高。而B(niǎo)ioMark^TM數(shù)字微流控芯片采用的材料是價(jià)格便宜的聚二甲基硅氧烷(PDMS)，采用軟刻蝕技術(shù)在芯片上加工了幾千個(gè)微泵閥結(jié)構(gòu)，可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化添加樣品和試劑功能，樣品通量最高達(dá)到487700。

事實(shí)上液滴陣列也是一種非常適合進(jìn)行微型化qPCR分析的技術(shù)，美國(guó)TTPLabTech公司開(kāi)發(fā)了一套納升級(jí)液滴陣列生成裝置，用于高通量蛋白結(jié)晶篩選。但是，該系統(tǒng)并沒(méi)有被用于qPCR系統(tǒng)，可能由于在液滴生成過(guò)程中不可避免地會(huì)伴隨水分蒸發(fā)以及PCR熱循環(huán)過(guò)程中極易導(dǎo)致液滴之間相互融合易位等問(wèn)題。然而，液滴陣列技術(shù)無(wú)論從成本，芯片設(shè)計(jì)，還是操作的容易程度等方面都是一種理想的用于微型化qPCR分析的平臺(tái)和技術(shù)。

三、發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種可實(shí)時(shí)定量進(jìn)行PCR檢測(cè)的反應(yīng)芯片，以及包括芯片的熒光檢測(cè)系統(tǒng)。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種液滴陣列PCR芯片，所述芯片是以單晶硅片或玻璃片為基材，采用標(biāo)準(zhǔn)光刻和濕法刻蝕技術(shù)制備得到，所述的芯片以單晶硅片或玻璃片為基材、在所述的基材上依次附著SiO₂氧化層、由SiO₂氧化層表面硅烷化生成的硅烷層，所述的硅烷層布置有光刻膠工藝刻蝕形成的可形成液滴狀陣列的親水坑陣列，所述微型親水陣列外圍設(shè)置有封閉成環(huán)的護(hù)欄，所述的護(hù)欄與所述硅烷層液密封連接。