[發(fā)明專利]中國(guó)南海疣鎬芋螺神經(jīng)毒素及其編碼序列和用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010620115.2
• 申請(qǐng)日: 2010-12-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102154300A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐安龍;強(qiáng)媛媛;王磊;任政華;吳赟;馮宇超
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C07K14/435;A61K38/17;A61P25/04;A61P21/00
• 代理公司: 廣州新諾專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44100
• 代理人: 華輝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種多肽及其編碼序列和應(yīng)用，尤其涉及一種芋螺神經(jīng)毒素多肽及其編碼序列和應(yīng)用。

背景技術(shù)

芋螺，亦稱雞心螺，系軟體動(dòng)物門(mén)，腹足綱，前鰓亞綱，芋螺科(Conidae)動(dòng)物之總稱。芋螺是一類肉食性海洋軟體動(dòng)物，分類學(xué)上屬腹足綱前鰓亞綱芋螺科，它們通過(guò)其毒管中的芋螺毒素麻醉動(dòng)物以幫助捕食.芋螺根據(jù)其食性可以分為三類：食魚(yú)性、食蟲(chóng)性和食螺性芋螺，其中食魚(yú)性芋螺的毒素對(duì)人和哺乳動(dòng)物毒性較大。芋螺毒素為其毒液中的有效成分，是一種具有獨(dú)特神經(jīng)藥理作用的小肽，由7-41個(gè)氨基酸殘基組成，一般富含二硫鍵。根據(jù)其二硫鍵的構(gòu)成情況可分為兩大類：含有多對(duì)二硫鍵及只含有一對(duì)或不含二硫鍵的。在近499種芋螺中據(jù)認(rèn)為有超過(guò)49999種芋螺毒素肽，根據(jù)其前體信號(hào)肽序列可以分為幾個(gè)超家族，如M、A和O)超家族，每個(gè)超家族的前體擁有共同的高保守的信號(hào)序列。

大量的研究表明，芋螺毒素具有獨(dú)特的能夠高特異選擇性識(shí)別結(jié)合其作用靶(受體門(mén)控離子通道，電壓門(mén)控離子通道)，產(chǎn)生拮抗劑(antagonist)或阻斷劑(blocker)的作用。芋螺毒素識(shí)別其作用靶具有高特異性及選擇性，它們只作用于某一類特定亞型的受體或通道。目前作用于受體門(mén)控離子通道的有nAchR拮抗劑、NMDA受體拮抗劑；作用于電壓門(mén)控離子通道阻斷劑的有Na⁺通道阻斷劑、k⁺通道阻斷劑Ca²⁺通道阻斷劑等。

目前已知的芋螺毒素大多是從食魚(yú)芋螺中分離得到，食蟲(chóng)芋螺的毒液研究的相對(duì)較少。至今已有數(shù)種芋螺毒素申請(qǐng)美國(guó)專利，它們?cè)阪?zhèn)痛、局部缺血性保護(hù)、癲癇治療、某些疾病診斷和受體研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，有的已進(jìn)入臨床研究或已被FDA正式批準(zhǔn)為治療新藥，用作特異診斷試劑和鎮(zhèn)痛藥。如由Olivera等從幻芋螺(Conus?magus)中分離的ω-CTX，MVIIA，已被美國(guó)FAD正式批準(zhǔn)為治療頑痛的藥物，其商品名Ziconotide。ω-芋螺毒素MVIIA是由25個(gè)氨基酸、3對(duì)二硫鍵組成的堿性親水性小肽，C端酰胺化，N端為Cys?？蛇x擇性抑制N型電壓敏感性鈣通道，廣泛用作神經(jīng)生物學(xué)探針和無(wú)致癮性鎮(zhèn)痛劑，并具有多種藥物發(fā)展前景；沿脊髓傳遞的Ziconotide能阻斷傷害感受器釋放神經(jīng)傳遞素，阻止疼痛信號(hào)傳入大腦，臨床表現(xiàn)出強(qiáng)大的鎮(zhèn)痛作用，效果優(yōu)于嗎啡等現(xiàn)有的鎮(zhèn)痛劑，用于艾滋病、癌癥及神經(jīng)痛患者的治療，無(wú)成癮性，且療效確切。來(lái)源不同的ω-CTX，盡管其氨基酸序列不同，但在結(jié)構(gòu)上的差異都不是很大，如來(lái)自地紋芋螺(C.geographus)的GVIA、GVIC、GVIIA和GVOIB等，和來(lái)自幻芋螺MVIIA、MVIIC、以及來(lái)自線紋芋螺(C.striatus)的SO3等ω-CTX，在藥理學(xué)方面有相似的作用。

我國(guó)關(guān)于芋螺毒素研究的報(bào)道不多，大多為綜述芋螺毒素的研究概況及應(yīng)用前景。盧柏松等，魏開(kāi)華等對(duì)我國(guó)的少數(shù)幾種芋螺(線紋芋螺，織錦芋螺和桶形芋螺)的毒素基因或毒液成份進(jìn)行了研究。我國(guó)近海的芋螺約有70種，主要分布在海南島，西沙群島和臺(tái)灣，大多數(shù)種類的芋螺毒素研究還未展開(kāi)。由于每種芋螺毒液都有自己特定的藥理學(xué)作用范圍和生物學(xué)活性，因而使芋螺毒素具有重要的理論研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。多樣性的芋螺毒素既可直接用作天然藥物，又可以作為設(shè)計(jì)新藥(用于治療重大疑難雜癥)的先導(dǎo)化合物。深入研究芋螺毒素，不僅對(duì)海洋制藥工業(yè)具有重要意義，而且可為我國(guó)芋螺海洋資源的開(kāi)發(fā)利用提供重要理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種中國(guó)南海疣鎬芋螺神經(jīng)毒素基因lv1.3。

本發(fā)明另一目的是提供上述神經(jīng)毒素基因lv1.3編碼的多肽lv1c。

本發(fā)明另一目的是提供上述多肽lv1c在制備神經(jīng)生物學(xué)研究的工具藥和鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所選擇的疣鎬芋螺屬于中國(guó)南海食蟲(chóng)性疣鎬芋螺(Conus?lividus)，采自海南省三亞市。

本發(fā)明采用構(gòu)建cDNA文庫(kù)的方法，從中國(guó)南海疣鎬芋螺毒管中克隆得到神經(jīng)毒素基因lv1.3。

中國(guó)南海疣鎬芋螺毒管cDNA文庫(kù)的構(gòu)建：分離毒管，提取總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈產(chǎn)物；再以A超家族的信號(hào)肽和3’UTR為引物，以cDNA為模板通過(guò)PCR進(jìn)行基因克隆，將PCR產(chǎn)物與pGEM-T?Easy?Vector相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化液分別涂平板，從平板上挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序。得到中國(guó)南海疣鎬芋螺神經(jīng)毒素基因lv1.3，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。