[發明專利]環肽YM-216391的生物合成基因簇

無效

• 申請號: 201010619958.0
• 申請日: 2010-12-28
• 公開（公告）號: CN102174530A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發明（設計）人: 唐功利;蹇曉紅;潘海學
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海有機化學研究所
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/52;C12N15/53;C12N15/57;C12N15/61;C07K5/02
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司 31213
• 代理人: 鄔震中

技術領域：

本發明屬于微生物基因資源和基因工程領域，具體涉及具有抗腫瘤活性的環肽YM-216391的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其應用。

技術背景：

環肽YM-216391(1，圖1)由高貴鏈霉菌Streptomyces?nobilis?JCM?4274所產生，是2005年由日本科學家K.Sohda等在尋找新的抗癌藥物的過程中發現的新型環肽類化合物，它具有良好的抗腫瘤活性[J.Antibiot.(2005)58，27-31；J.Antibiot.(2005)58，32-36]。環肽YM-216391具有獨特的化學結構，包含2，4-連接的4個噁唑環和1個噻唑環，其兩端由D-allo-異亮氨酸殘基-L-纈氨酸殘基-甘氨酸殘基組成的三肽連接并成環，該結構與受到科學家廣泛關注的端粒酶抑制劑Telomestatin(2，圖1)以及同樣具有抗腫瘤活性的IB-01211(3，圖1)、Urukthapelstatin?A(4，圖1)的結構非常相似。

體外實驗顯示環肽YM-216391對人宮頸癌HeLa?S3細胞生長具有很強的抑制活性，其細胞生長半數抑制劑量IC₅₀值僅為14nM。對39種腫瘤細胞系的體外篩選實驗初步表明，YM-216391可能導致腫瘤細胞的凋亡；同時通過與其他標準抗腫瘤藥物的對比分析顯示，YM-216391與其他抗腫瘤藥物的活性譜沒有特別明顯的相關性，因而不能由此推測可能的作用靶標或機制。而其活性譜與RNA聚合酶抑制劑Actinomycin?D、蒽環類抗腫瘤藥物Epirubicin以及組蛋白脫乙酰化酶抑制劑FR901228有一定相關性，然而體外生化實驗表明即使在10μM的濃度下(高于IC₅₀值500～1000倍)，YM-216391對組蛋白脫乙酰化酶仍然沒有任何抑制作用。此外，YM-216391與Telomestatin結構類似，Telomestatin是很強的端粒酶抑制劑(IC₅₀為5nM)，然而對于很多腫瘤細胞的生長抑制活性YM-216391卻比Telomestatin高50～250倍，因此兩者是否具有不同的機制尚不清楚[J.Antibiot.(2005)58，27-31]。關于環肽YM-216391的抗腫瘤活性的更深入的藥理學、作用機制以及構效關系研究正在進行中。

含噻唑啉和噻唑環的化合物除了具有明顯的生物學活性外，進一步的研究表明它們能通過氫鍵或配位作用與小分子或者金屬離子相結合。化學合成的含噻唑啉-噻唑環結構的手性大環分子與Pb²⁺和Cd²⁺具有較強的親和能力，并且在金屬離子的選擇上有高度的特異性，這在環境污染的檢測和治理上有很大的應用潛力[Chem.Commun.(2007)10，3444-3446]。因此，經結構改造后的環肽YM-216391的衍生物在結合并檢測重金屬離子方面也有很大的應用價值。

環肽YM-216391及其類似物的獨特的化學結構和良好的抗腫瘤活性吸引了許多有機化學家從事其化學合成研究[Chem.Commun.(2005)8，797-799；Org.Biomol.Chem.(2008)6，1994-2010；J.Med.Chem.(2008)51，5722-5730；Org.Lett.(2006)8，4165-4167；Org.Lett.(2007)9，809-811]。化學合成方法得到的大量結構類似物可以用于構效關系的研究等，對多聚噁唑環-噻唑環類環肽藥物發展具有重要意義。然而由于這些合成路線非常復雜，產率不高，因此還不能真正應用到藥物生產中。而通過基因工程改造，利用微生物發酵的方法在提高環肽YM-216391的產量以及獲得新的候選化合物方面都具有獨特作用。

我們以鏈霉菌來源的環肽YM-216391為目標分子，從克隆其在Streptomyces?nobilis?JCM?4274(購自日本RIKEN生物資源中心)中的生物合成基因簇出發，采用微生物學、分子生物學、生物化學及有機化學相結合的方法研究其生物合成，通過體內基因操作，異源表達、體外蛋白活性測定等方法，提高其發酵產量，研究其生物合成機理，并合理修飾YM-216391的生物合成途徑，探索結構穩定、活性更好、并能通過微生物大量發酵的新型YM-216391結構類似化合物。

發明內容：

本發明涉及一種由高貴鏈霉菌Streptomyces?nobilis?JCM?4274產生的具有抗腫瘤活性的環肽YM-216391的生物合成基因簇的克隆、測序、分析、功能研究及其應用。