[發(fā)明專(zhuān)利]新型雙作用靶點(diǎn)重組水蛭素突變體的優(yōu)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010618036.8
• 申請(qǐng)日: 2010-12-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102153646A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚樹(shù)華;王航;許靜
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)藥科大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/815
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/815;C12N15/09;C12N15/63
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程制藥領(lǐng)域或蛋白質(zhì)多肽藥物領(lǐng)域，涉及一種采用基因工程領(lǐng)域技術(shù)研制新型雙作用靶點(diǎn)重組水蛭素突變體的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

水蛭素是一種天然抗凝的蛋白質(zhì)多肽，由65～66個(gè)氨基酸組成，其分子如蝌蚪狀。水蛭素分子由2個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，它們分別與凝血酶分子表面兩個(gè)不同的表面位點(diǎn)作用。其N(xiāo)-端結(jié)構(gòu)域是一個(gè)由氨基酸1-47形成的球狀致密的核心結(jié)構(gòu)，它與凝血酶的活性位點(diǎn)(activesite)結(jié)合，抑制其催化活力；而其帶負(fù)電荷的羧基末端結(jié)構(gòu)域氨基酸(49-65)則與凝血酶的陰離子結(jié)合外側(cè)位點(diǎn)(anion?binding?exosite，或稱(chēng)纖維蛋白原識(shí)別位點(diǎn))結(jié)合，從而抑制凝血酶與纖維蛋白原的相互作用。在這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間存在一指狀結(jié)構(gòu)(finger?like?structure)從復(fù)合物中突出向外延伸，不與凝血酶接觸。這一指狀結(jié)構(gòu)系水蛭素氨基酸殘基27-31和36-40形成一反向平行β-折疊(antiparallel?β-sheet)鏈，指端由氨基酸殘基32-35形成柔性β-轉(zhuǎn)角，研究表明該指狀結(jié)構(gòu)并不參與凝血酶的抑制作用，屬于非功能必需區(qū)。

整合素(integrins)是一類(lèi)存在于血小板以及血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白受體，能與纖連蛋白、I型膠原、血纖維蛋白原等配體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的相互識(shí)別和作用，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附與通訊。研究發(fā)現(xiàn)，這些配體通常包含有一Arg?GlyAsp(RGD)序列，且這一功能性的RGD序列通常都位于暴露的、伸展的分子表面環(huán)狀結(jié)構(gòu)(loop)中。粘附配體如纖維蛋白原、纖連蛋白及Von?willebrand因子上的RGD序列可以識(shí)別存在于活化血小板上的最豐富的GPIIb/IIIa受體并與其結(jié)合而使得血小板聚集，從而起到一種靶向結(jié)合的作用，因此，該序列稱(chēng)為整合素吸附序列(integrin?affinity?sequence)。巧合的是，許多小分子蛇毒(如decorsin，trigramin，kistrin，echistatin等)分子表面的環(huán)狀結(jié)構(gòu)中也存在這一序列，故又稱(chēng)為粘附識(shí)別序列(adhesive?recognition?sequence)。

基于以上認(rèn)識(shí)，根據(jù)水蛭素分子天然結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)改造已具有極大可能。為此，我們采用loop移植技術(shù)，通過(guò)基因定點(diǎn)突變技術(shù)在其功能非必需區(qū)引入了整合素吸附序列(粘附識(shí)別序列)RGD，以期在不影響其原有的抗凝血酶活性的基礎(chǔ)上，另外獲得具有抗血小板聚集的生物活性，從而設(shè)計(jì)出比水蛭素更為優(yōu)越的既抗凝血酶又抗血小板聚集的雙功能水蛭素III變體藥物。然而，我們的前期研究結(jié)果(Tan，S.et?al.(2007).Mol?Biotechnol?36(1)，1-8)顯示，當(dāng)用整合素吸附序列RGD替代水蛭素III分子指狀結(jié)構(gòu)非功能區(qū)33～35位點(diǎn)時(shí)，R₃₃G₃₄D₃₅-rHV3沒(méi)有表現(xiàn)出抗血小板活性，而R₃₃G₃₄D₃₅S₃₆-rHV3則表現(xiàn)出抗血小板活性。這說(shuō)明緊隨RGD序列之后的第36位氨基酸殘基種類(lèi)對(duì)抗血小板聚集活性的高低至關(guān)重要。為此，如果對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)飽和突變分析，就可以發(fā)現(xiàn)最適合該關(guān)鍵位點(diǎn)的最佳氨基酸殘基，從而設(shè)計(jì)出結(jié)構(gòu)新穎、并具有抗凝血酶和最佳抗ADP誘導(dǎo)的血小板聚集藥理活性的雙作用靶點(diǎn)水蛭素新變體藥物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是在rHVIII和已構(gòu)建的R₃₃G₃₄D₃₅S₃₆-rHVIII基礎(chǔ)上，應(yīng)用基因定點(diǎn)飽和突變技術(shù)對(duì)緊隨RGD序列之后的第36位氨基酸進(jìn)行突變，以獲得R₃₃G₃₄D₃₅X₃₆-rHVIII突變體庫(kù)(X代表20種不同種氨基酸殘基)，并進(jìn)行分泌表達(dá)和分離純化，在此基礎(chǔ)上比較R₃₃G₃₄D₃₅X₃₆-rHVIII各種突變體的抗凝血酶活性比活力和抗ADP誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率，并從中篩選出與野生型水蛭素III的抗凝血酶活性比活力相當(dāng)，而抗ADP誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率最佳的雙作用靶點(diǎn)水蛭素新變體藥物。