[發明專利]陽離子化當歸多糖納米?；騻鬟f系統及其制法

有效

• 申請號: 201010613603.0
• 申請日: 2010-12-30
• 公開（公告）號: CN102154351A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 徐希明;王淼;余江南;鄧紋紋;曹霞
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;B82Y5/00
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 黃嘉棟

1.一種陽離子化當歸多糖納米?；騻鬟f系統，其特征是：它是一種用胺類化合物修飾的當歸多糖結合DNA質粒的基因傳遞系統，當歸多糖的分子量分布為30~50KD和80~100KD，其中按質量比計，?陽離子化當歸多糖:DNA質粒=1~200:1，陽離子化當歸多糖-DNA質粒納米復合物的粒徑為21-77nm，所述的胺類化合物為精胺、乙二胺或數均分子量為600Da-2000Da的聚乙烯亞胺。

2.一種制備權利要求1所述的陽離子化當歸多糖納米?；騻鬟f系統的方法，其特征是它包括以下步驟：

步驟1.陽離子化當歸多糖的制備：

A.?聚乙烯亞胺修飾的陽離子化當歸多糖的制備：

取0.1~1g精制的當歸多糖，溶于5~20ml磷酸鹽緩沖液（pH=7）；將活化羥基的連接劑溶解于5ml二氯甲烷中，所述的活化羥基的連接劑可以是N，N’-羰基二咪唑、苯并三唑碳酸酯、羰基咪唑、N,N’-二琥珀酰亞胺基硫酸酯中的任一種，在氮氣的保護下，首先在多糖液中加入催化劑三乙胺，再將活化羥基的連接劑的二氯甲烷溶液緩慢加入多糖溶液中，勻速攪拌，在20~100min內加完，加完之后，室溫反應90~150min，獲得活化的多糖溶液；將數均分子量為600Da-2000Da的聚乙烯亞胺（PEI）溶于1-20ml磷酸鹽緩沖液中，多糖與聚乙烯亞胺的質量比為0.5~4:1，加入催化劑三乙胺，在避光、氮氣保護、室溫條件下緩慢加入到活化的多糖溶液中，在90~150min內加完，避光、室溫下反應10h，整個反應在勻速攪拌下進行；反應完成之后的溶液經透析（截取分子量>3500Da）、凍干之后，得到PEI?修飾的當歸多糖；

B．精胺或乙二胺修飾的陽離子化的當歸多糖的制備：

（1）氧化當歸多糖的制備：

取0.2~1g精制的當歸多糖，溶解于20~100ml雙蒸水中，加入KIO₄，KIO₄與多糖中單糖單位的摩爾比為：0.5~5:1，迅速放到暗室，磁力攪拌，室溫反應72h；反應液加入1~20ml?乙二醇終止反應，按前述條件繼續反應30min；將反應液裝入透析袋（截取分子量>3500Da），在雙蒸水中透析48h；透析液凍干，得到氧化當歸多糖0.1~1.5g；

（2）精胺修飾的陽離子化當歸多糖的制備：

稱取0.1~0.5g?氧化當歸多糖，溶解于10~50ml?雙蒸水中；稱取精胺溶解于5ml的硼酸鹽緩沖液（pH=9），精胺與氧化多糖的醛基的摩爾比為0.5~5:1；將含有精胺的硼酸鹽溶液緩慢加入到當歸多糖溶液中，同時進行磁力攪拌；加完之后，磁力攪拌，室溫反應24h；然后，向反應液中加入0.1~1g?硼氫化鈉，相同條件下繼續反應48h；再向反應液中加入0.1~1g?硼氫化鈉，加入硼氫化鈉的總質量與氧化多糖的質量之比為：0.5~4:1，相同條件下繼續反應24h；將反應液裝入透析袋（截取分子量>3500Da），在雙蒸水中透析48h；透析液凍干，得到精胺修飾的陽離子化當歸多糖0.1~0.8g；

（3）乙二胺修飾的陽離子化當歸多糖的制備：

稱取0.1~0.5g?氧化當歸多糖，溶解于10~30ml?雙蒸水中；稱乙二胺溶解于5ml的硼酸鹽緩沖液（pH=9），乙二胺與氧化多糖的醛基的摩爾比為0.5~5:1；將含有乙二胺的硼酸鹽溶液緩慢滴加入當歸多糖溶液中，同時進行磁力攪拌；加完之后，磁力攪拌，室溫反應24h；之后，向反應液中加入0.1~1.0g?硼氫化鈉，相同條件下繼續反應48h；再向反應液中加入0.1~1.0g?硼氫化鈉，加入硼氫化鈉的總質量與氧化多糖的質量之比為：0.5~4:1，相同條件下繼續反應24h；將反應液裝入透析袋（截取分子量>3500Da），在雙蒸水中透析48h；透析液凍干，得到乙二胺修飾的陽離子化當歸多糖0.1~0.7g；

步驟3.?分別配制濃度為0.01~10mg/ml的三種陽離子化當歸多糖水溶液，取10~20μl陽離子當歸多糖水溶液和10~20μl?含0.1~2μg?DNA質粒溶液，分別在55℃加熱30~60min；立即混合，渦旋10~60s，即得到陽離子化當歸多糖納米粒基因傳遞系統。