[發明專利]三唑侖檢測試劑盒及其制備方法

無效

• 申請號: 201010610904.8
• 申請日: 2010-12-29
• 公開（公告）號: CN102539765A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 陳立柱;李峰;楊利
• 申請（專利權）人: 北京寶瑞源科技孵化有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/558;G01N33/543;G01N33/532
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技術領域

本發明涉及生物學免疫方法的測定技術領域，特別是涉及一種利用膠體金免疫層技術制作的一種三唑侖檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術

三唑侖又名海樂神、酣樂欣，淡藍色片，是一種強烈的麻醉藥品，口服后可以迅速使人昏迷暈倒，故俗稱迷藥、蒙汗藥、迷魂藥。可以伴隨酒精類共同服用，也可溶于水及各種飲料中。見效迅速，藥效比普通安定強45-100倍。三唑侖是當前國內最常用的苯二氮卓類藥物之一，常被犯罪分子用于麻醉搶劫和麻醉兇殺。據報道，三唑侖在體內吸收代謝快，其主要代謝產物是α-羥基三唑侖。由于三唑侖劑量少，在生物檢材中的三唑侖及其代謝產物含量均很低，因此對其提取檢驗困難。

有關三唑侖的檢測方法有很多，例如：高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法等方法，這些方法雖然檢測的靈敏度較高，檢測結果準確，但是存在需要昂貴的儀器設備，對檢測材料的要求高，需要提純處理等限制。因此研究具有快速、便攜等優點的檢測方法具有現實意義。本發明介紹了一種以膠體金免疫層析法快速檢測三唑侖的檢測試劑盒及其制備方法，該方法具有簡單、快速，無需任何儀器設備，經濟實用等特點，適用于快速定性檢測樣本中是否含有三唑侖。

膠體金免疫層析技術是20世紀九十年代以來在單克隆抗體技術、免疫層析技術及膠體金顯色技術基礎上發展起來的一項新型體外診斷技術。基于膠體金免疫層析技術可以制備膠體金試紙，膠體金試紙的原理是應用膠體金標記技術，以膠體金為示蹤物，利用抗原抗體特異性結合反應，利用特定的顯色反應在試紙上的顯色而判定檢測的結果，具有操作簡單、檢測快速、靈敏度高、特異性強，無須復雜的儀器等特點。

發明內容

本發明的目的在于提供一種簡單、快捷、靈敏度高、特異性強的三唑侖試劑盒及其制備方法，用于檢測待檢樣本中是否含有三唑侖。

一種用于檢測三唑侖的檢測試劑盒，包括樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊和PVC支撐板，在PVC支撐板上依次緊密粘附有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊。所述樣品墊為玻璃纖維；所述膠體金墊為膠體金標記的三唑侖單克隆抗體聚酯膜；所述硝酸纖維素膜上依次包被有檢測線(T線)和質控線(C線)，其中檢測線(T線)上包被了三唑侖-牛血清蛋白偶聯抗原，質控線(C線)上包被了羊抗鼠IgG多克隆抗體；所述吸樣墊為吸水紙。

本發明采用納米膠體金技術及抗原抗體特異性反應，應用免疫競爭抑制反應的原理制備而成，通過待檢樣本中含有的三唑侖與硝酸纖維素膜上檢測線(T線)包被的三唑侖-牛血清蛋白偶聯抗原競爭結合膠體金標記的三唑侖單克隆抗體，通過T線的顯色來判定待檢樣本中是否含有三唑侖。

本發明提供了一種三唑侖檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

(1)制備三唑侖偶聯抗原

將三唑侖與牛血清蛋白偶聯，合成三唑侖-牛血清蛋白偶聯抗原，作為三唑侖偶聯抗原。

(2)制備三唑侖單克隆抗體

采用三唑侖-牛血清蛋白偶聯抗原為免疫原免疫BALB/C小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗三唑侖單克隆抗體的雜交瘤細胞株；以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用Protein?G柱進行純化，獲得三唑侖單克隆抗體。

(3)制備膠體金

取0.01％的氯金酸水溶液，加熱煮沸。根據需要迅速加入1％枸櫞酸三鈉水溶液1ml，繼續煮沸約5min，出現橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒的大小為20-40nm。

(4)制備膠體金墊

取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液，用0.1mol/L?K₂CO₃將膠體金溶液的pH值調至7.0-9.0，室溫放置30分鐘；在上述溶液中加入三唑侖單克隆抗體，使三唑侖單克隆抗體的濃度為10-60μg/ml膠體金，混合均勻后，室溫放置30分鐘；加入10％的牛血清蛋白(BSA)溶液使其濃度為10-60μl/ml，混合均勻，室溫放置30分鐘；12000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用初始膠體金體積的膠體金復溶液溶解；12000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用30％-100％初始膠體金體積的膠體金復溶液溶解，得到三唑侖單克隆抗體-膠體金標記物；將三唑侖單克隆抗體-膠體金標記物按1mL鋪40-70cm2聚酯膜的比例均勻鋪在聚酯膜上，再置干燥間，在溫度38℃，濕度小于30％的條件下干燥24±2小時，制成膠體金墊。

上述膠體金復溶液為含0.01-0.1％的Tris，1.0-3.0％的蔗糖、0.1-1.0％的BSA的0.02M?pH7.0-9.0的磷酸鹽緩沖溶液。