[發明專利]單鏈非編碼MicroRNA三及其用途

無效

• 申請號: 201010610278.2
• 申請日: 2010-12-28
• 公開（公告）號: CN102140452A
• 公開（公告）日: 2011-08-03
• 發明（設計）人: 陳智;陳峰;鄭敏;李淑萍;劉東成
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明涉及一種MicroRNA的乙肝重癥病人血漿中的表達水平及其在預測和診斷乙型肝炎重癥化中的作用。

背景技術

目前全球估計有3.5億慢性乙肝病毒(HBV)攜帶者，有三分之一的人口感染過HBV。在我國，乙型肝炎是最為嚴重、最廣泛的傳染病之一，感染率高達60％，約有1.2億人攜帶HBV。乙型肝炎的發病率居傳染病首位，死亡數居傳染病第三位。

乙肝重型肝炎是一類表現為短期大量肝細胞壞死導致肝功能衰竭的綜合癥，其死亡率極高，發展迅速，兇險而且臨床預后差。并嚴重威脅人們身體健康的肝疾病，因此，早期診斷，以便及時采取有效的治療措施尤其重要。

MicroRNA是由機體內源基因轉錄的約70nt的發夾狀結構前體(pre-MicroRNA)被Dicer酶切割后產生的約22nt的非編碼單鏈RNA片段，在進化過程中高度保守，能通過與靶基因mRNA特異性的堿基互補配對，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯，廣泛地負調控靶基因的表達。MicroRNA作為一種新的基因干預工具，具有高效、特異、快速等優點，為基因調控的研究和基因治療的發展帶來了新的視角。MicroRNA非常穩定，用于臨床診斷試劑的研發具有重復性好、容易操作等優點。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種利用單鏈非編碼MicroRNA200a制備診斷試劑盒以診斷重癥肝炎。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種單鏈非編碼MicroRNA，單鏈非編碼MicroRNA200a為SEQ?ID?NO：1所示的序列。

本發明還同時提供了上述單鏈非編碼MicroRNA在制備診斷乙型重癥肝炎的試劑盒中的應用。

本發明還同時提供了一種用于診斷乙型重癥肝炎的試劑盒，包括PCR試劑、探針、上游引物和下游引物；探針為SEQ?ID?NO：5所示的序列，上游引物為SEQ?ID?NO：3所示的序列，下游引物為SEQ?ID?NO：4所示的序列。

作為本發明的用于診斷乙型重癥肝炎的試劑盒的改進：PCR試劑為1×TaqManUniversal?PCR?MasteMix。

MicroRNA是一類高度保守的單鏈RNA(約22～23個核苷酸)，生物信息學分析表明，每個microRNA可能調節數百個靶基因，提示microRNA可能參與調節細胞生命活動中眾多的信號轉導途徑，在細胞增殖、分化、凋亡、免疫反應及血管生成等一系列過程中發揮作用。另外，MicroRNA的異常表達將會導致生理的異常和疾病的產生，相反疾病的產生也將導致MicroRNA的表達水平的改變，人們可以利用它來反映疾病的程度并做出相應的治療。

MicroRNA序列測定相對簡單，通過基因工程技術可以比較容易地分離純化人類外周血中存在的MicroRNA，并對其進行測序。到目前為止已經報道了超過800個MicroRNA序列，但是由于MicroRNA功能的復雜性，大部分MicroRNA的功能和用途仍屬未知，因此，尋找和開發有用的MicroRNA用于臨床診斷和治療是當前研究熱點。美國應用生物系統公司根據目前的研究現狀研發了MicroRNA芯片(TaqMan?MicroRNA?Arrays)，它包含大部分已知的MicroRNA的反轉錄引物，利用該芯片可以檢測出已知序列的這些MicroRNA表達水平的變化情況。本發明利用該芯片對乙型肝炎重癥患者血漿中MicroRNA進行檢測，以正常人為對照，對患者作一個比較全面的MicroRNA圖譜，從中找出與乙型肝炎重癥化病情變化密切相關的MicroRNA分子。利用該分子可研發預測和診斷肝炎重癥化診斷試劑。

在本發明中，發明人通過檢測乙型肝炎重癥患者血漿中MicroRNA?200a的表達水平，觀察乙型肝炎重癥狀態下MicroRNA的改變情況。本發明選取正常人和已被確診為乙型肝炎重癥患者的血漿，從血漿中提取RNA，利用MicroRNA表達譜芯片(美國應用生物系統公司Human?MicroRNA?Array?A(B))對MicroRNA進行分析。結果發現，MicroRNA?200a在乙型肝炎重癥患者血漿中顯著上調，即，該MicroRNA在乙型肝炎重癥患者血漿中表達較正常人明顯增高。提示MicroRNA?200a在乙型肝炎重癥化中起著重要的調控作用，同時該MicroRNA可以作為乙型肝炎重癥化的診斷標志物。

采用本發明的方法來早期診斷乙型肝炎重癥化，具有如下優點：

本發明確認了MicroRNA200a作為診斷乙肝重型肝炎的潛在靶點，能用于快速檢測和診斷。