[發(fā)明專利]一種辣椒DN突變體在煙草抗高溫基因工程中的應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010609355.2
• 申請(qǐng)日: 2010-12-28
• 公開（公告）號(hào): CN102127543A
• 公開（公告）日: 2011-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何水林;邱愛連;蔡漢陽(yáng);劉林林;官德義;劉志欽;陳彥生;牟少亮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12N15/82
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種辣椒DN-CaROP1突變體及其超表達(dá)載體的構(gòu)建及在基因工程中的應(yīng)用，更具體地涉及到了該辣椒突變體在茄科植物煙草抗高溫基因工程中的應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

植物生長(zhǎng)、發(fā)育和對(duì)環(huán)境應(yīng)答是其特定的遺傳系統(tǒng)和所處的環(huán)境條件相互作用下通過(guò)復(fù)雜的生理生化過(guò)程實(shí)現(xiàn)的，總是受到較為嚴(yán)密的調(diào)控以使其產(chǎn)生足夠的光合產(chǎn)物并合理的分配和使用這些光合產(chǎn)物，最終使植物在特定的環(huán)境下獲得最大的生存和傳衍的機(jī)會(huì)。由鈣信使系統(tǒng)、植物內(nèi)源激素、磷酸激酶系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄因子等組成的信號(hào)傳導(dǎo)是植物生長(zhǎng)、發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境調(diào)控的重要環(huán)節(jié)，植物細(xì)胞可感知外界環(huán)境各種信息并進(jìn)行信號(hào)的整合、傳遞，最終將信號(hào)傳遞進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，使植物產(chǎn)生有利于其生存和傳衍的生理生化反應(yīng)。

辣椒(Capsicum?annuum?L.)是典型的茄科植物，也是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蔬菜。辣椒的生產(chǎn)長(zhǎng)期受到病害及其它各種逆境的困擾，對(duì)農(nóng)藥和化肥等的過(guò)分依賴導(dǎo)致的環(huán)境、健康方面的隱患促使人們從遺傳改良上或從栽培管理上采取更加可持續(xù)的、切實(shí)可行的對(duì)策，需要從分子水平上對(duì)辣椒等茄科植物的抗逆分子機(jī)制作更深入的剖析和了解。從應(yīng)答逆境的信號(hào)傳遞入手是剖析辣椒抗逆分子機(jī)制的重要途徑，因此，辣椒抗逆信號(hào)傳遞分子機(jī)制研究已經(jīng)引起了人們的高度重視，并在膜定位相關(guān)受體蛋白（An?et?al.,2008）、鈣信使相關(guān)蛋白(Choi?et?al.,?2009)、激酶(Chung?et?al.,2004)、轉(zhuǎn)錄因子(Lee?at?al.)等多個(gè)信號(hào)傳遞聯(lián)結(jié)開展了大量的研究，但人們的對(duì)辣椒抗逆及其與生長(zhǎng)發(fā)育之間的關(guān)系及其分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)還相當(dāng)有限。

鑒于ROP位于調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆信號(hào)傳遞途徑的上游，在植物生長(zhǎng)發(fā)育及對(duì)環(huán)境逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，從辣椒的ROP分離和功能鑒定入手可能是揭示辣椒等茄科植物抗逆分子機(jī)制的重要契入點(diǎn)。

自在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)ROP以來(lái)，已有越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)ROP在植物體內(nèi)多種信號(hào)途徑中起關(guān)鍵作用，每一成員可能作用于不同的途徑，幾種不同的途徑可能融合于同一個(gè)ROP（Jones?et?al.,2005；Yalovsky?et?al.,2008），同時(shí)在植物中也存在ROP的功能冗余，導(dǎo)致缺少某一種ROP時(shí)很少有明顯的表型變化，所以在研究ROP時(shí)很少只單獨(dú)采用基因功能敲除法進(jìn)行研究。研究ROP功能的重要手段之一就是構(gòu)建DN（dominant?negative）和CA（constitutive?active）突變體，前者是使ROP鎖定在GDP結(jié)合態(tài)形成失活型突變體，后者是將ROP鎖定于GTP束縛態(tài)形成激活型突變體（Kost?et?al.,1999；Li?et?al.,1999；Lemichez?et?al.,2001；Li?et?al.,2001），這種突變體蛋白的表達(dá)打亂了內(nèi)源ROP蛋白的激活態(tài)和失活態(tài)之間的平衡，有助于ROP蛋白的功能分析（Yang，2002）。目前尚未有利用DN突變體研究植物抗高溫的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)現(xiàn)提供了一種辣椒DN突變體在煙草抗高溫中的應(yīng)用，將大力促進(jìn)煙草抗高溫基因工程的發(fā)展與應(yīng)用。

本發(fā)明的辣椒DN突變體為DN-CaROP1突變體，該突變體基因至少含有如SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列。

構(gòu)建方法如下：

將辣椒DN-CaROP1突變體與CaMV35S啟動(dòng)子核心序列融合，構(gòu)建成DN-CaROP1的超表達(dá)載體。所述的CaMV35S啟動(dòng)子核心序列為

CGACCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGAC。所述辣椒DN-CaROP1是從UV-B輻射辣椒葉片的cDNA文庫(kù)中分離獲得的CaROP1基因的DN突變體。

構(gòu)建的超表達(dá)載體在茄科植物煙草抗高溫基因工程中的應(yīng)用。將所述超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化EHA105?農(nóng)桿菌，采用葉盤遺傳轉(zhuǎn)化法侵染煙草得到轉(zhuǎn)基因煙草，?提高該轉(zhuǎn)基因煙草的高溫抗性，尤其是在43℃高溫下。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明的辣椒DN-CaROP1突變體在煙草中的超表達(dá)與野生型煙草相比顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗高溫能力，該基因在植物抗高溫基因工程中具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為CaROP1中的保守功能域；

圖2為CaROP1與其它ROP家族成員的系統(tǒng)發(fā)育樹；

圖3為CaROP1定點(diǎn)突變圖；

圖4為入門載體pDONR207；

圖5為超表達(dá)載體pK7WG2；