[發(fā)明專利]基于熒光量子點(diǎn)編碼二氧化硅球進(jìn)行多種轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010604671.0
• 申請(qǐng)日: 2010-12-24
• 公開（公告）號(hào): CN102169089A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王利兵;胥傳來;趙媛;陳偉;郝昌龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64;C09K11/08
• 代理公司: 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所 32104
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

1.一種熒光量子點(diǎn)編碼二氧化硅球進(jìn)行多種轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)方法，其特征在于：

A、采用下列不同體積比熒光量子點(diǎn)編碼二氧化硅球的制備：

535nmQDs︰629nmQDs=2︰1，

535nmQDs︰629nmQDs=1︰2，

535nmQDs︰602nmQDs︰650nmQDs=1︰1︰2，

535nmQDs︰602nmQDs︰650nmQDs=1︰2︰2

（1）將15mL的曲拉通和15mL的正己醇混合10min，加入60mL的環(huán)己烷，攪拌20min；

（2）取1400μL?535nmQDs和700μL?629nmQDs混合均勻，加入到步驟（1）溶液中，均勻攪拌30min，配置成微乳體系；

（3）向上述微乳體系中加入2mL氨水，混合30min，加入2mL正硅酸四乙酯TEOS和2mL?3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES，水解12h；

（4）加入15mL丙酮破乳，攪拌30min，離心醇洗3次，將二氧化硅球分散在水中，制得535nm：629nmQDs=2：1編碼的二氧化硅球；

（5）調(diào)節(jié)QDs的種類和比例，制備其它三種熒光QDs編碼的二氧化硅球：

取700μL?535nmQDs和1400μL?629nmQDs混合，其他按上述相同條件制得535nmQDs︰629nmQDs=1︰2編碼的二氧化硅球；

取500μL?535nmQDs，500μL?602nmQDs和1000μL?650nmQDs混合，其他按上述相同條件制得535nmQDs︰602nmQDs︰650nmQDs=1︰1︰2編碼的二氧化硅球；

取400μL?535nmQDs，800μL?602nmQDs和800μL?650nmQDs混合，其他按上述相同條件制得535nmQDs︰602nmQDs︰650nmQDs=1︰2︰2編碼的二氧化硅球；

B、量子點(diǎn)編碼二氧化硅球檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、油菜、棉花：

（1）分別制備編碼的二氧化硅球-?probe?DNA偶聯(lián)物：

取2μL羧基修飾的probe?DNA?1，加入50μL的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽EDC和50μL的N-羥基琥珀酰亞胺NHS，活化30min后，加入100μL的535nmQDs︰629nmQDs=2︰1編碼二氧化硅球水溶液中，反應(yīng)2h，離心洗滌3次，制得編碼的二氧化硅球-?probe?DNA?1偶聯(lián)物；

同樣probe?DNA?2活化后和535nmQDs︰629nmQDs=1︰2編碼二氧化硅球偶聯(lián)，離心洗滌3次，制得編碼的二氧化硅球-?probe?DNA?2偶聯(lián)物；

probe?DNA?3活化后和535nmQDs：602nmQDs︰650nmQDs=1︰1︰2編碼的二氧化硅球偶聯(lián)，離心洗滌3次，制得編碼的二氧化硅球-?probe?DNA?3偶聯(lián)物；

probe?DNA?4活化后和535nmQDs︰602nmQDs︰650nmQDs=1︰2︰2編碼的二氧化硅球偶聯(lián)，離心洗滌3次，制得編碼的二氧化硅球-?probe?DNA?4偶聯(lián)物；

（2）將四種Target?DNA1，Target?DNA2，Target?DNA3，Target?DNA4各取取2μL混合在200μL、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入100μL?的535nmQDs：629nmQDs=2：1編碼二氧化硅球-?probe?DNA1，室溫雜交12h，離心，分別將上清液和沉淀放在不同的管中；

將沉淀離心、超純水洗滌3次，分散在200μL、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入經(jīng)氨基-6-甲基香豆素乙酸鹽AMCA染料標(biāo)記的capture?DNA1，室溫雜交12h，離心洗滌3次，取沉淀分散在200μL、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中，進(jìn)行熒光掃描，即得到進(jìn)行Target?1檢測(cè)的熒光譜圖，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因玉米的檢測(cè)；

（3）在步驟（2）離心所得上清液中加入100μL?的535nmQDs︰629nmQDs=1︰2編碼二氧化硅球-probe?2，室溫雜交12h，離心，分別將上清液和沉淀放在不同的管中；

將沉淀離心洗滌3次，分散在200μL、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入AMCA標(biāo)記的capture?DNA2，室溫雜交12h，離心洗滌3次，取沉淀分散在200μL、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中，進(jìn)行熒光掃描，即得到進(jìn)行target?2檢測(cè)的熒光譜圖，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因大豆的檢測(cè)；

（4）在步驟（3）離心所得上清液中加入100μL?的535nmQDs︰602nmQDs︰650nmQDs=1︰1︰2編碼二氧化硅球-probe?3，室溫雜交12h，離心，分別將上清液和沉淀放在不同的管中；

將沉淀離心洗滌3次，分散在200μL、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入AMCA標(biāo)記的capture?DNA3，室溫雜交12h，離心洗滌3次，取沉淀分散在200μL、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中，進(jìn)行熒光掃描，即得到進(jìn)行target?3檢測(cè)的熒光譜圖，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因油菜的檢測(cè)；

（5）在步驟（4）離心所得上清液中加入100μL?的535nmQDs︰602nmQDs︰650nmQDs=1︰2︰2編碼二氧化硅球-probe?4，室溫雜交12h，離心，分別將上清液和沉淀放在不同的管中；

將沉淀離心洗滌3次，分散在200μL、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入AMCA標(biāo)記的capture?DNA4，室溫雜交12h；離心洗滌3次，取沉淀分散在200μL、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中，進(jìn)行熒光掃描，即得到進(jìn)行target?4檢測(cè)的熒光譜圖，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因棉花的檢測(cè)。