[發明專利]高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（JXA1-R株）實時熒光RT-PCR檢測方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201010604525.8
• 申請日: 2010-12-24
• 公開（公告）號: CN102140527A
• 公開（公告）日: 2011-08-03
• 發明（設計）人: 田克恭;王立林;遇秀玲;倪建強;夏應菊;曲萍;翟新驗;陳西釗
• 申請（專利權）人: 中國動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 北京金闕華進專利事務所(普通合伙) 11224
• 代理人: 吳鴻維

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)的實時熒光RT-PCR檢測方法。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome?virus，PRRSV)引起的一種以懷孕母豬繁殖障礙、尤其哺乳仔豬呼吸困難為特征的高度接觸性傳染病。本病在1987年首次暴發于美國，隨后在加拿大、歐洲與亞洲相繼出現，目前已經在世界范圍內流行，每年造成巨大的經濟損失。我國在1995年首次出現PRRS，隨后迅速蔓延。2006年我國暴發了由豬繁殖與呼吸綜合征高致病性變異毒株(highly?pathogenic?PRRSV，HP-PRRSV)引起的以體溫高、發病率高、死亡率高為主要臨床特征的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(highly?pathogenicPRRS，HP-PRRS)，給我國養豬業造成了極其嚴重的打擊。HP-PRRS被世界動物衛生組織(OIE)列為必須報告的法定傳染病之一，是我國《一、二、三類動物疫病病種名錄》中的一類動物疫病。目前防控本病的主要措施是疫苗免疫接種。而今高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)已在國內得到廣泛應用，它以其良好的免疫保護效力和安全性對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的防控起到了重要作用。

傳統的PRRSV檢測方法主要包括病毒的分離與鑒定、免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)、間接免疫熒光試驗(IFA)、間接酶聯免疫吸附試驗(間接ELISA)和反轉錄-聚合酶鏈反應試驗(RT-PCR)等，它們在病毒診斷與進出口檢驗檢疫中發揮了重要作用，但各自在敏感性、特異性或時效性等方面存在不足，且難以將疫苗株(JXA1-R)與野毒株區分從而達到檢測疫苗株(JXA1-R)的目的。目前，高致病性PRRSV變異株的實時熒光定量RT-PCR等檢測方法雖然已經建立，但是仍然無法特異性針對疫苗株(JXA1-R)進行檢測。因此，建立一種快速簡便、特異性強、敏感性高、可靠性好的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)的檢測方法意義重大。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術不足，提供一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)的實時熒光RT-PCR檢測方法。此方法快速簡便、特異性強、敏感性高、可靠性好，為評價高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)免疫效果及疫苗生產的質量監控提供強有力的技術支持。

本發明是通過以下技術方案實現的：

中國動物疫病預防控制中心獸醫診斷室(農業部獸醫診斷中心)提供活疫苗及如下病毒：高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)(制備用毒株由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，CGMCC?No.2467)；高致病性豬繁殖與呼吸綜合征2006-2010年不同時期野毒株；美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典毒株、歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒，及各自活疫苗；其他豬源病毒包括馬動脈炎病毒(EAV)、豬瘟病毒(CSFV)、日本乙型腦炎病毒(JEV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬細小病毒(PPV)、豬圓環病毒2型(PCV2)。

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)特異性引物和探針設計：所述的特異性引物，指的是：長度為20個堿基左右的寡核苷酸鏈，與高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)Nsp2基因高度保守區的特異性核苷酸片段完全相同或者反向互補；所述的特異性探針，指的是：長度為13到21個堿基之間的寡核苷酸鏈，其5’端標記FAM或HEX等熒光激發基團，3’端標記自身不發光的淬滅基團，同時另增加一個小溝結合物(minor?groovebinder，MGB)分子，與高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)Nsp2基因高度保守區的特異性核苷酸片段完全相同或反向互補。

本文所列出的核苷酸序列，均由5’端向3’端方向書寫。

用于檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)的寡核苷酸引物對特征如下：由序列為TCCACGCATCCTCGGG的上游引物LV-HP-PRRSV-F3和序列為TGCTCTCGTCAGACTCCCGT的下游引物LV-HP-PRRSV-R2組成；