[發(fā)明專利]一種牛奶中新霉素殘留的一步ELISA檢測(cè)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010604438.2
• 申請(qǐng)日: 2010-12-24
• 公開（公告）號(hào): CN102128923A
• 公開（公告）日: 2011-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 匡華;胥傳來;徐乃豐;屈昌龍;馬偉;徐麗廣;王利兵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/543
• 分類號(hào): G01N33/543;G01N21/17;G01N27/447
• 代理公司: 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所 32104
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

一種針對(duì)牛奶中新霉素殘留的一步ELISA檢測(cè)方法，屬于免疫分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

新霉素（neomycin，NEO）是由鏈霉素菌屬弗氏鏈霉菌產(chǎn)生的多組分抗生素，含新霉素B和C兩種同分異構(gòu)體（結(jié)構(gòu)式如下所示），但只有新霉素B具有抗菌活性。新霉素為水溶性的堿性抗生素，市場(chǎng)上常用制劑為白色或類白色粉末狀的硫酸新霉素，具有較強(qiáng)的吸濕性，長期暴露在空氣中會(huì)因?yàn)槲账侄苯?。而新霉素本身具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性，對(duì)與酸，堿，熱等環(huán)境因素的耐受性明顯強(qiáng)于其它抗生素。新霉素極易溶于水，但幾乎不溶于乙醇、乙醚、丙酮或氯仿等有機(jī)溶劑中，具有旋光活性。

新霉素屬氨基糖苷類抗生素藥物，由于其廣譜抗菌性，能夠極好的抑制革蘭氏陰性菌的生長，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和獸藥領(lǐng)域。在獸醫(yī)臨床上，新霉素成為預(yù)防和治療畜禽細(xì)菌性腸炎的首選藥物之一，其功效特佳。目前，我國和其他一些國家還將新霉素添加到動(dòng)物飼料中，一方面提高飼料利用率，促進(jìn)動(dòng)物的生長，同時(shí)預(yù)防由細(xì)菌感染引起的疾病而避免損失。但是新霉素吸收毒性大，主要表現(xiàn)為耳毒性和腎毒性，新霉素殘留對(duì)人體健康危害較大。為了保障民眾的食品安全，增強(qiáng)動(dòng)物源食品的國際競(jìng)爭(zhēng)力，必須將動(dòng)物源食品中新霉素殘留的檢測(cè)納入常規(guī)檢測(cè)中去。

有關(guān)新霉素含量測(cè)定的方法很多，國內(nèi)外主要報(bào)道的有微生物學(xué)法、薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、免疫分析法、毛細(xì)管電泳法和離子交換法等。在這些殘留分析方法中，TLC法主要作為一種提純手段，而電泳法和微生物學(xué)方法因?yàn)椴僮鞣?!-- SIPO -->瑣、靈敏度不高，檢測(cè)速度較慢和特異性較低而受到限制，因此高效液相色譜法和免疫學(xué)方法成為新霉素主要分析方法。高效液相色譜法較之微生物法有較高的靈敏度和特異性，但設(shè)備昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員素質(zhì)也有較高要求，分析費(fèi)時(shí)而不易推廣，同時(shí)它還需要復(fù)雜繁瑣的樣品前處理且不能同步篩選大量的樣品，這些影響因素的存在無疑是不適合及時(shí)監(jiān)控，現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的。目前免疫分析是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)，以抗體為核心試劑，具有高選擇性、高靈敏度等特點(diǎn)。目前國外所采用的基本上都是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked?immunosorbent?assay,?ELISA)，尤其是用于牛奶、血漿和蜂蜜樣品中的殘留檢測(cè)，能夠達(dá)到很好的檢測(cè)效果。Jin等成功制備抗新霉素的單克隆抗體，并采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定血漿和牛奶中新霉素殘留半數(shù)抑制濃度IC₅₀=50?ng/mL．在磷酸鹽緩沖溶液、血漿，牛奶中的檢測(cè)限（LOD）分別是6.85?ng/mL、3.61?ng/mL，2.73?ng/mL。

但目前的新霉素免疫分析方法檢測(cè)時(shí)間相對(duì)仍然較長，檢測(cè)限不夠高。因此開發(fā)針對(duì)動(dòng)物源食品中新霉素殘留的更加便捷、快速、靈敏的測(cè)定技術(shù)，建立新霉素殘留的快速檢測(cè)方法及相應(yīng)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種更加快速、簡(jiǎn)單、靈敏的一步ELISA方法，用于檢測(cè)牛奶中的新霉素殘留。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種牛奶中新霉素殘留的一步ELISA檢測(cè)方法，包括新霉素抗原的合成與鑒定，新霉素抗血清效價(jià)的測(cè)定和新霉素抗血清特異性的檢測(cè)。

工藝步驟為：

(1)?利用戊二醛法合成新霉素抗原（免疫原和包被原）；

(2)?利用紅外光譜法（IR法）和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）對(duì)抗原進(jìn)行鑒定；

(3)?通過免疫獲得抗新霉素抗血清；

(4)?利用間接ELISA法測(cè)定新霉素抗體的效價(jià)；

(5)?利用一步ELISA法檢測(cè)新霉素抗體的特異性；

所述新霉素抗原：免疫原和包被原的合成：

①稱取80?mg?新霉素NEO，40mg?牛血清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA溶于10?mL、0.01?mol/L的磷酸鹽緩沖液中；

②充分溶解后逐滴加入1.5mL?質(zhì)量濃度1%?戊二醛溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30?min；

③加入112?mg?NaBH₄，4℃冰箱中靜置1h；

④反應(yīng)液用0.01mol/L?磷酸鹽緩沖液透析3天，間隔6h換液；

所得NEO-BSA偶聯(lián)物為免疫原，所得NEO-OVA偶聯(lián)物為包被原。

所述利用紅外光譜法進(jìn)行新霉素免疫原的鑒定：

①分別稱取NEO標(biāo)準(zhǔn)品，BSA和NEO-BSA樣品各2?mg；

②分別加入干燥的溴化鉀KBr?200?mg，混合物置于瑪瑙研缽中，在紅外燈照射下混勻、充分研磨；