[發明專利]一種檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株的試劑盒

有效

• 申請號: 201010602121.5
• 申請日: 2010-12-23
• 公開（公告）號: CN102140526A
• 公開（公告）日: 2011-08-03
• 發明（設計）人: 田克恭;孫明;喬明明;陳曦;曲萍;遇秀玲;王傳彬;陳西釗
• 申請（專利權）人: 中國動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京金闕華進專利事務所(普通合伙) 11224
• 代理人: 吳鴻維

技術領域

本發明涉及生物技術，尤其涉及動物疫病的預防控制。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome?virus，PRRSV)主要引起母豬發熱、流產，斷奶前后的仔豬死亡率升高，不同年齡豬呼吸障礙等為臨床特征的疾病。1991年，荷蘭學者Terpstra等人在感染豬體內分離到歐洲型PRRSV，命名為Lelystad病毒(LV)；同年，美國學者Benfield等人分離到美洲型PRRSV，命名為VR-2332。該病毒1996年傳入中國并長期存在，成為危害我國養豬業的主要豬病病毒之一。

近年來，我國學者相繼分離鑒定了美洲型PRRSV的CH-1a、S1、HB-1和HB-2等毒株。2006年6月份以來，我國多個省份的養豬場、戶爆發豬“高熱病”疫情，給養豬業造成了巨大的經濟損失，中請人在研究該病的過程中，發現了其主要病原——高致病性PRRSV變異株，這一類的高致病性PRRSV變異株以Nsp2基因第1594～1680位核苷酸連續缺失為特征，并分離鑒定了代表性病毒株——NVDC-JXA1株(分類命名：繁殖與呼吸綜合征病毒；保藏編號：CGMCC?No.1964)。

2006年，申請人針NVDC-JXA1病毒株建立了特異性的RT-PCR檢測方法，用于檢測該病毒感染。但是2009年以來，通過在自然界中不斷演化，我國高致病性PRRSV變異株已經在基因組序列上發生了一些變化；同時，由于CH1-R疫苗等毒株逐漸推廣使用，對原有RT-PCR檢測方法造成了非特異性的干擾。這些情況的出現，使得原有的RT-PCR檢測方法和試劑盒已經不能有效地鑒別檢測田間流行的高致病性PRRSV變異株。

本發明基于對2006年至2010年分離的多個高致病性PRRSV變異株基因序列分析，針對分離毒株Nsp2基因序列的共同特征，設計了一系列PCR?引物，并經過優化和試驗篩選，獲得了一對PCR引物。采用該引物組裝的RT-PCR試劑盒，可以檢測出當前發現的全部高致病性PRRSV變異株，并且不受經典PRRSV(是指Nsp2基因未發生第1594～1680位核苷酸連續缺失的毒株)和CH1-R疫苗毒株的干擾，從而能夠特異、敏感地檢測出高致病性PRRSV變異株。因此，該試劑盒能對高致病性PRRSV診斷和監測起到重要作用。

發明內容

本申請涉及針對高致病性PRRSV變異株NSP2基因片斷設計的RT-PCR引物對，用于檢測高致病性PRRSV變異株(本發明中特指Nsp2基因第1594～1680位核苷酸連續缺失為特征的毒株)。該引物對包括上游引物SEQ?ID?NO：1和下游引物SEQ?ID?NO：2的核苷酸序列為：

SEQ?ID?NO：1：5′-CGCAGAACAAAGTCTGTCAAAAG-3′

SEQ?ID?NO：2：5′-TGAGTCAGCGTTGCCTTCACAG-3′

本申請還提供一種能夠特異、敏感地檢測出高致病性PRRSV變異株的RT-PCR試劑盒，包含如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示的引物對。試劑盒的其他組分均按照常規方法配制，具體為：

1.RNA提取試劑：由醋酸鈉溶液350μl，酚/氯仿/異戊醇混合液3.5ml，異丙醇3.5ml，75％乙醇12ml，無菌DEPC水450μl，RNA酶抑制劑24μl組成。

2.RT-PCR反應試劑：由RT反應液200μl(含反轉錄引物序列：RT引物5’-TCgCCCTAAT-3’)、RNA酶抑制劑24μl、AMV反轉錄酶12μl、PCR反應液200μl、0.5U/μLTaq?DNA聚合酶25μl、礦物油300μl組成。

3.電泳檢測試劑：包括50×TAE電泳緩沖液20ml、溴化乙錠溶液100μl、上樣緩沖液50μl。

4.陰性對照350μl、陽性對照350μl、變性液7ml。

附圖說明

圖1：SEQ?ID?NO：1

圖2：SEQ?ID?NO：2