[發(fā)明專利]一種抗Cry1Ac晶體蛋白兔單克隆抗體的制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010601127.0
• 申請(qǐng)日: 2010-12-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102120770A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭曉冬;倪庚;沈金兒;劉娜;陸蕾;馮勁松
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/18
• 分類號(hào): C07K16/18;C12N5/16
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

1.一株抗Cry1Ac晶體蛋白的兔單克隆抗體的制備方法,其特征在于它的步驟如下：

1)兔子免疫

????將400~600μg的免疫抗原Cry1Ac蛋白與等量弗氏不完全佐劑混合，完全乳化后，采用背部皮下3~6點(diǎn)注射2~3只新西蘭大白兔，在開(kāi)始免疫后的第三、五、七、九周，分別用150~250mg的免疫抗原蛋白與弗氏不完全佐劑混合后以同樣的方法進(jìn)行免疫；

2)細(xì)胞融合

????選擇第五次免疫之后血清效價(jià)高的兔子先進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，8~10天后取無(wú)菌脾臟，制備單細(xì)胞懸浮液，融合當(dāng)天選擇生長(zhǎng)旺盛、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞相融合，質(zhì)量百分比為48％~52％的聚乙二醇為融合劑，體積百分比為18%~22%的HAT作為選擇性培養(yǎng)基，鋪于40塊96孔板中，其中H是濃度為0.8×10^-6~1.2×10^-6mol/L的次黃嘌呤，A是濃度為3.5×10^-9~4.5×10^-9mol/L的氨基蝶呤，T是濃度為1.4×10^-7~1.8×10^-7mol/L的胸腺嘧啶核苷；

3)雜交瘤細(xì)胞的篩選

????細(xì)胞融合后第8~12天隨機(jī)選擇40板中的2塊板對(duì)克隆子通過(guò)間接酶聯(lián)免疫吸附進(jìn)行預(yù)篩，確定是否需要更換細(xì)胞培養(yǎng)液；第15~19天通過(guò)間接酶聯(lián)免疫吸附進(jìn)行初篩，初步確定是陽(yáng)性的克隆子，并將對(duì)應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)移到24孔培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)一周；第22~26天通過(guò)間接酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行復(fù)篩，篩選出陽(yáng)性克隆，并確定3~5株生長(zhǎng)狀態(tài)最好且表達(dá)特異性抗體能力最強(qiáng)的細(xì)胞株進(jìn)入重組載體的構(gòu)建，其他克隆子-20℃凍存，經(jīng)重組獲得的細(xì)胞株選擇一株親和力和分泌抗體能力強(qiáng)，特異性高的克隆子經(jīng)體外培養(yǎng)，Sepharose?CL-4B?Protein?A柱分離純化并得到目標(biāo)單克隆抗體。