[發明專利]一種基因突變的檢測方法

有效

• 申請號: 201010600645.0
• 申請日: 2010-12-23
• 公開（公告）號: CN102533957A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 高勁松;張英杰
• 申請（專利權）人: 遼寧琦潤生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

技術領域

本發明涉及基因檢測領域，特別提供了一種基因突變的檢測方法。

背景技術

人體癌基因或抑癌基因的突變常常是腫瘤發生的早期事件，檢測它們的突變情況，可以早期發現腫瘤，因此有著十分重要的臨床意義。目前對基因突變的檢測，常見有測序法；基因芯片雜交法；PCR-RFLP方法；PCR擴增產物毛細管電泳分析法；PCR高分辨熔解曲線分析技術；PCR熒光定量探針法；等位基因特異引物PCR擴增法等，這些方法都能不同程度的檢測出基因突變情況，但它們的一個共同缺點是僅僅對突變體的定性分析，缺乏對突變體的精確定量。除此之外，這些方法或多或少還存在儀器價格高，操作難度大，存在一定假陰性和假陽性，檢測成本高，臨床普及程度低，不能同時大規模檢測臨床標本等缺點。如：直接測序法是突變分析的金標準，能發現已知和未知突變位點，但每個位點均需PCR擴增，然后測序，成本較高、工作量大、周期長、價格昂貴、不適合大樣本分析；普通PCR-RFLP方法技術簡便，價格便宜，適宜少量樣本的實驗室檢測，但RFLP僅能檢測有酶切位點的突變，無酶切位點不能檢測，費時費力；芯片技術與傳統的儀器檢測方法相比具有高通量、微型化、自動化、防污染等特點，適用于全基因組突變掃描，不適宜單個基因的突變位點檢測，且精度低，價格昂貴。PCR高分辨熔解曲線分析技術，能高通量檢測基因的突變情況，試劑成本較低，但因其熒光信號來自染料，特異性受到影響，而且檢測儀器是升級版的熒光PCR儀，價格高昂，普及受限；Taqman探針法適合已知突變位點，常常需要兩條探針，并必須對探針序列和反應條件進行優化，不然有假陽性的發生；等位基因特異引物PCR擴增法，根據突變位點設計3'末端與突變位點堿基互補或錯配的特異PCR引物，通過凝膠電泳或熒光信號等方法檢測PCR擴增產物的有或無，從而檢測基因型中的突變。該方法最關鍵的是設計與3'末端突變位點堿基互補或錯配的兩條特異引物，引物設計不好，將導致高背景的交叉擴增，若對SNP分析尚能接受，但對病人基因的突變體檢測，就是大忌，不然會導致較高的假陽性。

目前對基因突變的檢測都離不開PCR技術。簡單的說，PCR就是利用DNA聚合酶對特定基因做體外的大量合成，通過DNA聚合酶特異性的復制，可以將一段基因放大為原來的一百億至一千億倍，從而易于進一步的分析。PCR反應必須具備的條件為：復制的DNA模板、特異的一對引物、DNA聚合酶、合成的原料及反應需要的緩沖體系。PCR由變性、退火、延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③?引物的延伸：DNA模板--引物結合物在Taq?DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA?鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需?2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因復制到成百上千億倍。

現有技術方案中，PCR熒光Taqman探針法和等位基因特異引物PCR擴增法與本發明最為相近。PCR熒光Taqman探針法與常規PCR比較，多加入了一個特異性的熒光探針，該探針兩端分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團，探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，PCR儀檢測不到熒光信號；?PCR擴增時（在延伸階段），Taq?酶的?5'?－?3'?切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條?DNA?鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與?PCR?產物形成完全同步，這也是定量的基礎所在。由于多加入了一條特異性探針，使得其擴增特異性大幅度提高，保證了檢測的可靠性，為臨床應用打開了方便之門。此外熒光Taqman探針法需要熒光PCR儀，全封閉檢測，無需PCR后處理，有效杜絕了PCR產物導致的假陽性問題。

PCR熒光Taqman探針法檢測基因突變，需分別設計兩條探針，一條同突變體完全互補，一條同正常序列完全互補，其原理是根據Taqman探針在互補序列上有堿基錯配時，在確定的退火溫度下，同堿基序列不能很好結合，易于脫落，故不能檢測到信號，從而做到突變型探針檢測突變點，野生型探針檢測正常序列，反之則不能。