[發明專利]一種抗鰻弧菌和遲鈍愛德華氏菌的多效價活疫苗、相關表達載體及應用

有效

• 申請號: 201010600524.6
• 申請日: 2010-12-22
• 公開（公告）號: CN102154348A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 劉琴;張元興;鄭雁;王啟要
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/62;C12N15/31;C12N15/53;C12N9/04;C07K14/195;A61K39/106;A61P31/12
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 王潔

技術領域

本發明涉及疫苗技術領域，更具體地，涉及多效價活疫苗技術領域，特別是指一種抗鰻弧菌和遲鈍愛德華氏菌的多效價活疫苗、相關表達載體及應用。

背景技術

中國是水產養殖業大國，但隨著高密度大規模養殖技術的發展，病害問題日益突出，對水產養殖業造成了巨大的威脅。據初步統計，目前危害我國水產養殖生物的疾病已達400～500種，全國每年水產養殖發病率達50％以上，損失率為20％左右。魚類疾病達200多種。其中，弧菌病和愛德華氏菌病是在水產養殖中經常爆發的兩大類疾病，致死率極高。

弧菌病是最早發現的魚類細菌性疾病之一。鰻弧菌(Vibrio?anguillarum)是水產養殖中常見的一類弧菌。它多在高鹽度的水體中流行，分布區域幾乎為世界性的，其發生沒有宿主的種屬選擇性差異，也無具體的季節和時間上的區分，其流行適宜溫度為25～32℃，超過28℃時流行極為迅速，幾日之內即可造成養殖動物的大量死亡，嚴重威脅經濟魚類的養殖。

遲鈍愛德華氏菌通常被分離于冷血動物腸道及其他環境尤其是淡水中，在溫血動物和人中也可被分離到。遲鈍愛德華氏菌主要對鰻鱺、鲇魚和其他動物致病，并且能感染人類，引起疾病多表現為腹部膨脹，體表皮膚有不同程度的出血性潰爛。在世界不少國家和地區均有由該菌引起水產養殖動物的病害發生及流行，并且造成得損失嚴重。

長期以來，人們使用藥物治療的方法來對抗水產病害。但是藥物在魚體內的殘留，產生耐藥性病原體；導致水體污染并破壞正常的生態環境等不良后果使人們意識到藥物治療的不足之處。而疫苗具有針對性強，抗病周期長，可終身免疫，防治主動等特點，因此成為了世界水產養殖行業中研究和開發的主要前沿和應用領域。其中減毒活疫苗更以其給藥方便，免疫保護力高，成本低廉為人們所廣泛關注。

微生物表面展示技術是利用基因重組方法把靶蛋白(外源肽段或蛋白質結構域)基?因序列與特定的載體蛋白基因序列(又叫定位序列)融合后導人微生物宿主細胞，從而使靶蛋白表達并定位于微生物細胞表面。用這一技術設計疫苗可使表達的抗原充分展示在微生物的表面，其在免疫遞呈方面可能更為有效，為發展高效安全的活疫苗開拓了更大的空間。利用這一技術在大腸桿菌等細菌的疫苗開發中已得到了成功應用(Stathopoulos?C，et?al.Characterization?of?Escherichia?coli?expressing?anLpp-OmpA(46-159)-PhoA?fusion?protein?localized?in?the?outer?membrane.Appl.Microbiol.Biotechnol.1996(45)，112-119)。在病原菌中展示外源抗原蛋白更可能起到多效價的作用。

在水產養殖的環境中，魚類易同時受到多種病原菌的侵害。因此，研究能同時抵抗多種病原菌的疫苗十分經濟實用。目前，尚未見以鰻弧菌和遲鈍愛德華氏菌為主要防治對象的商品化多效價減毒活菌疫苗。

發明內容

本發明的主要目的就是針對以上存在的問題與不足，提供一種抗鰻弧菌和遲鈍愛德華氏菌的多效價活疫苗、相關表達載體及應用，該多效價活疫苗設計獨特巧妙，能同時抗鰻弧菌和遲鈍愛德華氏菌，與傳統疫苗比具有免疫保護效果更好的特點，使用簡便，安全，費用低廉，為預防養殖魚類的疾病提供一種安全，有效，經濟的方式，有實際的商業開發應用價值，適于大規模推廣應用。

在本發明的第一方面，提供了一種重組表達載體，其特點是，包括表達載體和整合在所述表達載體上的外源核苷酸序列，所述外源核苷酸序列編碼丁香假單胞菌的冰核蛋白外膜定位元件和遲鈍愛德華氏菌的3-磷酸甘油脫氫酶的融合蛋白，其中所述冰核蛋白外膜定位元件用于介導所述3-磷酸甘油脫氫酶的外膜定位。

所述遲鈍愛德華氏菌可以選擇任意的遲鈍愛德華氏菌。較佳地，所述遲鈍愛德華氏菌是遲鈍愛德華氏菌EIB202，保藏編號為：CCTCC?NO：M?208068。

所述丁香假單胞菌可以選擇任意的丁香假單胞菌。較佳地，所述丁香假單胞菌是丁香假單胞菌丁香致病變種ICMP3023。

所述表達載體可以選擇任何合適的表達載體。較佳地，所述表達載體為pUC18質粒。

所述冰核蛋白外膜定位元件可以是任何丁香假單胞菌的冰核蛋白外膜定位元件，所述3-磷酸甘油脫氫酶可以是任何遲鈍愛德華氏菌的3-磷酸甘油脫氫酶。較佳地，所述冰核?蛋白外膜定位元件的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：9所示；所述3-磷酸甘油脫氫酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。