[發明專利]枯草芽孢桿菌LS03漆酶及其編碼基因

無效

• 申請號: 201010599491.8
• 申請日: 2010-12-22
• 公開（公告）號: CN102154149A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 趙敏;盧磊;王天女;杜美惠;李泰侖;趙麗艷
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/02;C12N15/53;C12R1/125
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種細菌漆酶及其編碼基因，具體涉及一株枯草芽孢桿菌LS03的芽孢漆酶及其編碼基因，屬于應用微生物領域。

背景技術

漆酶(EC?1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，它可利用活性中心的銅離子催化氧化多種結構的芳香化合物，同時將分子氧還原成水。由于漆酶催化的底物范圍十分廣泛，因此漆酶酶已被廣泛應用于造紙工業、紡織工業、食品工業以及土壤的生物修復等領域。

在自然界中，漆酶廣泛分布于植物、真菌和細菌中，特別是真菌，是目前漆酶的主要生產者。雖然目前對細菌漆酶的理論研究不如真菌漆酶深入，但細菌具有生長快、易于培養的特點，細菌漆酶較真菌漆酶在堿性環境和高溫下具有更好的穩定性。由于工業造紙廢水等一般溫度較高，堿性較強，真菌漆酶在實際應用中受到穩定性差的限制，因此細菌漆酶在工業上具有更好的應用前景。由于細菌芽孢對高溫、高壓、極端pH以及高鹽等多種不利因素具有較強的抗逆性，因此芽孢桿菌屬的芽孢漆酶會因芽孢這一特殊構造的特性而表現出更好的溫度穩定性和pH穩定性。

隨著分子生物學技術的不斷發展，眾多的漆酶基因已經得到了克隆和深入分析。通過克隆芽孢漆酶基因及其編碼的氨基酸序列，有助于了解細菌漆酶在空間結構和催化特性方面與真菌漆酶存在的差異，此外，還可以通過定點誘變等技術對漆酶基因進行改造，提高細菌漆酶工業應用性能。

發明內容

本發明目的是提供一種枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)LS03，同時本發明的目的還在于提供一種枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)LS03芽孢漆酶的編碼基因。

本發明提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)LS03已于2010年10月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCC?No.4262。

上述枯草芽孢桿菌菌株是從中國黑龍江省伊春市涼水國家自然保護區森林表層土壤分離獲得，可催化氧化漆酶典型的底物ABTS，丁香醛連氮和2，6-二甲氧基苯酚。枯草芽孢桿菌LS03菌株革蘭氏染色陽性，芽孢中生，有鞭毛。在固體Luria-Bertani(LB)培養基上，37℃培養24h，菌落微黃色、扁平呈圓形，菌落表面濕潤、光滑，菌落邊緣呈葉狀，菌落半透明且正反顏色一致。菌株的最適生長溫度為37℃，最適生長pH為7.0，可耐受1％-13％的NaCl。

本發明所提供的枯草芽孢桿菌漆酶基因，來自于枯草芽孢桿菌LS03，CGMCC?No.4262，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ?ID?No：1的DNA序列；

2)編碼序列表中SEQ?ID?No：2蛋白質序列的多核苷酸；

3)與序列表SEQ?ID?No：1限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。

序列表中序列1的DNA序列由1542個堿基組成，該基因的讀碼框為自5’端第1位到第1542位堿基，包含1542個堿基對。

本發明也涉及多肽，其具有漆酶活性并被上述定義的核酸分子所編碼。本發明進一步涉及多肽，其氨基酸序列以上述方式與SEQ?ID?No：2的氨基酸序列是相同的或同源的，序列表中SEQ?ID?No：2由513個氨基酸組成。

具體實施方式

以下的實施方式是為了更好地理解本發明。

以下實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為可購買到的生化試劑。其中細菌基因組提取試劑盒和膠回收試劑盒是Omega公司產品，T載體和其他工具酶等均為TaKaRa公司產品。

實施例1枯草芽孢桿菌LS03芽孢漆酶基因的克隆

1.菌株漆酶基因的克隆

將上述菌株挑至5mL?LB液體培養基中，37℃，200rpm，培養過夜。參照Omega公司細菌基因組提取試劑盒說明書提取上述菌株的基因組DNA，并經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

采用基因組DNA為模板，以上游引物“CGGGGATCCGACACTTGAAAAATTTG”(酶切位點BamH?I)和下游引物“CCGCTCGAGTTATTTATGGGGATCAG”(酶切位點Xho?I)擴增菌株枯草芽孢桿菌LS03芽孢漆酶基因。