[發明專利]豬繁殖與呼吸綜合征膠體金抗體檢測試紙條

無效

• 申請號: 201010599013.7
• 申請日: 2010-12-20
• 公開（公告）號: CN102532309A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 栗紹文;牟林琳;何啟蓋;徐高原;畢丁仁;陳煥春
• 申請（專利權）人: 華中農業大學;武漢科前動物生物制品有限責任公司
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N5/20;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于動物免疫學檢測技術領域，具體涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金免疫層析抗體檢測試紙條，它包括一種特異單克隆抗體的制備與應用。?

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine?Reproductive?and?Respiratory?Syndrome，簡稱PRRS)，又稱藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種傳染病，以成年豬早產、流產、死胎，仔豬呼吸障礙，以高熱、高致病性和高死亡率為特征。近年來由于病毒不斷變異，嚴重危害著世界養豬業的發展。?

本病診斷方法很多，根據臨床癥狀及病理變化可以作出初步診斷，確診必須依靠實驗室診斷。抗體檢測方法有間接酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、血清中和試驗等。如專利公開號CN1525170“檢測豬繁殖與呼吸綜合征抗體的ELISA試劑盒及用法”，提供了一種特異、敏感的間接ELISA抗體檢測方法。但這些方法存在著各種不同的缺點，如需要專門的儀器、操作復雜、檢測時間長、操作人員需經過專業培訓、技術要求條件高，費用昂貴等。?

膠體金免疫層析技術是在免疫滲濾的基礎上發展起來的一種快速檢測方法，其原理是將膠體金標記蛋白或抗體涂覆于金標墊，于固相膜上包被抗體或蛋白，并與樣品墊吸水墊組合到一起，制備膠體金免疫層析試紙條。該方法重復性好、靈敏度高，操作簡單，結果快速準確、直觀易辨，并可大量制備，工藝簡單，生產成本低廉，適合基層及突發事件的大批量現場檢測和流行病學調查。豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金抗原檢測方法已有相關的的專利報道，如公開號CN101363865“一種豬藍耳病毒膠體金檢測試紙條、其制備方法及其應用”、公開號CN201285399“檢測豬繁殖障礙性病毒傳染病病原的試紙條”。而有關膠體金抗體檢測方法如公開號CN101363858“一種豬藍耳病毒抗體膠體金檢測試紙條、其制備方法及其應用”，它是在硝酸纖維膜(NC膜)上包被豬藍耳病毒N蛋白和抗豬藍耳病毒的N蛋白多克隆抗體，但該專利文獻并詳細公開豬藍耳病病毒的基因組序列，也沒有提供擴增該病毒N蛋白的特異片段的核苷酸序列，同時沒有提供其質粒載體的構建物理圖譜和酶切位點，導致本領域的技術人員無法實施該發明并達到該發明所示的效果。另外，多克隆抗體不宜標準化，導致金標抗體包被條件需要反復摸索，也是該專利存在的一個缺點。?

發明內容

本發明的一個目的在于克服現有技術的缺陷，利用構建的單克隆抗體制備豬繁殖與呼吸綜合征膠體金免疫層析抗體檢測試紙條，可用于快速、方便檢測血清中豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體。本發明的試紙條尤其適合不具備實驗室條件的不發達國家的基層獸醫站和防疫部門使用。?

本發明以間接法的原理，利用膠體金免疫層析技術及豬繁殖與呼吸綜合征重組N蛋白和一種鼠抗豬IgG?Fc單克隆抗體，制備了一種檢測豬PRRSV抗體的膠體金免疫層析快速檢測試紙條，其特點在于使用了一種鼠抗豬IgG?Fc單克隆抗體，由于該單克隆抗體利用現有方法不可以重復獲得，因此在申請日之前，申請人已將獲得的分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株4F9送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)進行了專利程序的保藏，其保藏日為2010年11月4日，保藏號為CCTCC?NO：C2010105。從抗體的篩選上與上述專利文獻報道的多克隆抗體的技術路線明顯不同。?

本發明通過以下技術方案實施：?

一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金抗體檢測試紙條，由吸水墊、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜、樣品墊、PVC背襯板細裝成，所述的玻璃纖維膜上結合有膠體金標記的鼠抗豬IgG?Fc單克隆抗體。在所述的硝酸纖維素膜上的檢測線部位劃線包被有豬繁殖與呼吸綜合征病毒重組N蛋白。在所述的質控線部位劃線包被有兔抗鼠IgG抗體。所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒重組N蛋白由原核表達制備獲得(詳細技術方案見實施例部分)。?

一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒膠體金抗體檢測試紙條的制備方法，其步驟包括：?

1)制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒重組N蛋白，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所述。利用現有方法不可重復獲得兔抗鼠IgG抗體和鼠抗豬IgG?Fc單克隆抗體，其保藏號為CCTCC?NO：C2010105；?

2)樣品墊及金標墊的準備：將玻璃纖維膜用已配好的封閉液浸濕，于37℃下過夜烘干；?