[發明專利]非洲爪蟾白細胞介素8的cDNA及其克隆方法和重組應用

無效

• 申請號: 201010599005.2
• 申請日: 2010-12-21
• 公開（公告）號: CN102121014A
• 公開（公告）日: 2011-07-13
• 發明（設計）人: 張雙全;崔縣偉
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12N15/24
• 分類號: C12N15/24;C12N15/10;C12N15/09;A61K38/20;A61P37/04;C07K14/54
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及生物基因工程領域，具體涉及非洲爪蟾白細胞介素8(Xenopus?tropicalis?IL-8)cDNA及其克隆、表達技術。

背景技術

白細胞介素8（IL-8）是1987年發現的第一個趨化因子，當時被命名為單核細胞衍生的中性粒細胞趨化因子，在炎癥中起重要的作用。近年來隨著其他具有趨化功能物質的發現，IL-8的生物學活性得到了進一步的確認。在炎性疾病時，炎癥灶內存在大量白細胞，IL-8對白細胞具有化學激動和趨化效應，使白細胞游走能力加強，并增進白細胞抗感染免疫應答。而且研究表明IL-8mRNA的表達與疾病發生相伴隨，隨著疾病的轉歸而消長。最新的研究表明IL-8通過提高抗凋亡基因BCL-2及MMP-2和MMP-9的表達來調節血管內皮細胞的繁殖和存活從而在血管發生中發揮重要作用。

根據Genebank、EMBL、DDBJ國際三大主要核酸序列數據庫的搜索結果得知，到目前為止人、鼠、豬（哺乳類）雞、鴨、鴿子（鳥禽類）、鮭魚、河鯰、黑線魚（魚類）、中國軟殼龜（爬行類）等?的IL-8?cDNA已被克隆，并分別已在GenBank數據庫中申請了序列號，而至今模式生物中作為兩棲類代表的非洲爪蟾白細胞介素8（XtIL-8）的cDNA還未被克隆出來，關于非洲爪蟾IL-8基因的研究在整個國內外還處于完全空白狀態。非洲爪蟾是發展生物學的重要模式生物，只要將DNA或mRNA注入卵母細胞或發育中的胚胎，科學家就可以在對照下研究蛋白質，故其在發展生物學上的地位舉足輕重。IL-8一直是趨化因子研究領域的核心，在炎癥疾病和免疫調節中具有廣泛作用，還作為快速診斷細菌感染的指標。因此關于此類低等生物IL-8功能的研究有助于完善IL-8功能的研究，并為兩棲類動物炎癥性疾病的預防與治療提供理論依據。由于在各種非特異性炎癥性疾病發生過程中均有IL-8?參與,并且IL-8?基因易受外界刺激而被激活,IL-8?在炎癥疾病和免疫調節中具有廣泛作用。IL-8?也為抗炎藥物研發提供了新思路。近年來，隨著對細胞因子研究的不斷深入和分子生物學技術的發展，大量的細胞因子得以克隆及重組表達，許多細胞因子基因工程藥物面市，給治療疾病提供了新的手段，同時創造了巨大的經濟和社會效益，因此，重組XtIL-8蛋白具有潛在的巨大市場應用價值。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種從非洲爪蟾提取白細胞介素8cDNA，并提供非洲爪蟾提取白細胞介素8?cDNA的克隆方法及重組技術。

本發明從非洲爪蟾中克隆到白細胞介素8cDNA，它具有SEQ?ID?NO.1所示的序列。

非洲爪蟾白細胞介素8，它具有SEQ?ID?NO.2所示的序列。

本發明的非洲爪蟾白細胞介素8cDNA的克隆方法如下：

（1）運用電子克隆的方法克隆出非洲爪蟾白細胞介素8的CDS區設計引物：

正義寡核苷酸引物：XtIL-8F：?5’-?ATGGAAACCAAGAGAAGTGTCCTG?-3’?(SEQ?ID?NO.3)

反義寡核苷酸引物：XtIL-8R：?5’-?TTAAAGAGCAGAAACAGGTGTCT?-3’??(SEQ?ID?NO.4)

（2）從非洲爪蟾脾臟中提取總RNA，

（3）通過RT-PCR方法，以上述引物XtIL-8F及XtIL-8R為特異性引物，擴出編碼區全長cDNA序列，克隆入pMD19-T載體，并對其堿基序列進行測定。

上述非洲爪蟾白細胞介素8cDNA的克隆方法具體操作如下：

（1）根據電子克隆出的非洲爪蟾白細胞介素8cDNA序列設計特異性的正義寡核苷酸引物XtIL-8F（5’-?ATGGAAACCAAGAGAAGTGTCCTG?-3’）與反義寡核苷酸引物XtIL-8R（5’-?TTAAAGAGCAGAAACAGGTGTCT?-3’）

（2）應用RNA抽提試劑TRIzol?(Invitrogen?公司)，按照操作手冊，提取出非洲爪蟾脾臟細胞的總RNA，