[發明專利]一種可代謝木糖的釀酒酵母工程菌無效

申請號：	201010596022.0	申請日：	2010-12-20
公開（公告）號：	CN102127512A	公開（公告）日：	2011-07-20
發明（設計）人：	高嵐;張曉陽;夏黎明;杜風光	申請（專利權）人：	浙江大學;上海天之冠可再生能源有限公司
主分類號：	C12N1/19	分類號：	C12N1/19;C12R1/865
代理公司：	杭州天勤知識產權代理有限公司 33224	代理人：	胡紅娟
地址：	310027 浙***	國省代碼：	浙江;33
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種代謝釀酒酵母工程
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種可代謝木糖的釀酒酵母工程菌。

背景技術

石油資源的日漸枯竭，使燃料乙醇的生產和應用在經濟發展和戰略安全上顯示出重大意義。同時，國際糧食價格的不斷飆升成為燃料乙醇大規模生產和推廣的瓶頸。自然界豐富的植物纖維資源中，目前只有3-4％被有效利用。木糖在木質纖維素水解物中含量高達30％，是僅次于葡萄糖的一種單糖，充分利用木糖發酵生產乙醇，可以大大降低生產成本(J.N.Nigam，2001)。

釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)作為單細胞真核生物，易培養、生長周期短，已廣泛應用于異源基因的表達。雖然釀酒酵母能夠高產乙醇并對木質纖維素水解液中的抑制物有較強抗性(Tang?YQ?et?al.，2006)，但不能利用木糖，而只能利用其異構體木酮糖，使釀酒酵母無法成為木質纖維素乙醇生產的優勢菌株。所以構建能利用木糖產乙醇的釀酒酵母工程菌株的重要途徑之一是克隆天然利用木糖的酵母菌的兩個關鍵酶基因，即木糖還原酶基因XYL1(xylose?reductase)和木糖醇脫氫酶基因XYL2(xylitoldehydrogenase)，并使其在釀酒酵母細胞中表達。

釀酒酵母以其高效的產乙醇能力和較強的乙醇耐受性成為乙醇和食品行業的重要生產菌株。但其最適發酵溫度是25℃至30℃，在生產過程中往往需要向發酵罐噴灑大量的冷凝水(Kiran?Sree.et?al.，2000a；Sridhar?etal.，2002)或使用其它手段加以降溫，這無疑增加了生產成本和污染風險。乙醇發酵工業中，酵母發酵前將原料液降溫至30℃的成本占總生產成本的30％左右，而若只降至37℃左右，則可降低10％的生產成本。

發明內容

本發明提供了一種可代謝木糖的釀酒酵母工程菌，該釀酒酵母工程菌可以木糖為唯一碳源，發酵產生乙醇。

一種釀酒酵母工程菌，包括宿主細胞和重組載體，其特征在于：所述重組載體中包含由第一啟動子、木糖還原酶基因、第二啟動子、木糖醇脫氫酶基因以及抗性標記基因依次連接組成的基因表達盒。

所述的第一啟動子為釀酒酵母磷酸丙糖異構酶啟動子(pTPI)，所述的第二啟動子為釀酒酵母磷酸甘油激酶啟動子(pPGK)。該兩種啟動子均為組成型啟動子，不受葡萄糖抑制，無需木糖誘導。

所述的木糖還原酶基因的堿基序列如SEQ?ID?NO.7所示，所述的木糖醇脫氫酶基因的堿基序列如SEQ?ID?NO.9所示。之所以采用P.stipitis作為基因來源，主要在于其使用不同輔因子時的酶活比為0.65(NADH/NADPH)，較其它酵母的這一比值更高，因此將其木糖還原酶基因和木糖脫氫酶共表達于受體細胞中時，有助于減輕胞內氧化還原不平衡情況，從而減少副產物積累。

所述的抗性標記基因為G418抗性基因，便于釀酒酵母陽性轉化子的篩選。

所述的宿主細胞為釀酒酵母CBS?1200，該細胞可耐高溫。

所述的重組載體包含釀酒酵母的同源序列，重組載體能夠整合到宿主的染色體中，提高遺傳穩定性。所述的同源序列如SEQ?ID?NO.13所示。能將基因以高拷貝數整合于釀酒酵母rDNA重復序列上。

本發明釀酒酵母工程菌可以同時表達木糖還原酶和木糖醇脫氫酶，能夠以木糖為唯一碳源生長，為后續構建木糖和葡萄糖共發酵產乙醇的工程菌株奠定了基礎，并可以該工程菌株為基礎進一步篩選和改造，使其以木質纖維素為原料生產乙醇，從而大大降低乙醇的生產成本。

附圖說明

圖1為表達載體的P-R-K的物理圖譜；

圖2為表達載體的pB-D的物理圖譜；

圖3為表達載體P-RD-K的物理圖譜；

圖4為表達載體PK-rDNA的物理圖譜；

圖5為檢驗重組菌株為陽性菌株的電泳圖譜。

具體實施方式

實施例1啟動子、木糖還原酶基因和G418抗性基因表達盒的構建