[發明專利]豬早期胚胎發育前期培養液及后期培養液

無效

• 申請號: 201010593871.0
• 申請日: 2010-12-17
• 公開（公告）號: CN102093978A
• 公開（公告）日: 2011-06-15
• 發明（設計）人: 張德福;戴建軍;吳彩鳳;張樹山;張廷宇
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 上海唯源專利代理有限公司 31229
• 代理人: 劉秋蘭

技術領域

本發明涉及發育生物學，具體涉及一種豬早期胚胎發育前期培養液及豬胚胎后期培養液。

背景技術

早期胚胎培養是胚胎生物技術的基礎和關鍵環節，對于體外受精、胚胎分割、胚胎嵌合、核移植和轉基因動物的構建都具有重要的意義。現有的早期胚胎培養系統能夠成功地支持重構胚發育到囊胚階段，但是發育至囊胚比率沒有體內高，而且體外培養系統培養的胚胎質量也差于體內胚胎。人們對早期胚胎發育的機制仍知之甚少，同時體外培養也不能完全模擬體內環境：一方面，體內胚胎處于微量的液體環境中，而在體外培養的胚胎多置于較多的培養液中，使得胚胎自分泌產生的因子均被稀釋而無效果。另一方面體內胚胎始終處于一種動態的環境中，胚胎通過輸卵管到達子宮的過程中周圍的營養環境持續變化，以滿足胚胎不同發育階段的營養需求；而在體外培養時，許多傳統胚胎培養系統是一個靜止的環境，在整個植入前時期只有一種培養基。此外，體外培養系統中也缺乏任何雌性生殖道旁分泌因子。總的來說，現階段體外培養的胚胎在數量上和質量上都不如體內胚胎，這告訴我們胚胎的體外培養體系還不十分完美，還需要繼續深入研究并建立更好更接近生理環境的培養系統。

目前豬的胚胎從合子到囊胚在體外有以下幾種體外培養液：如改良的Whitten培養液、北卡羅來納州立大學研制的培養液(North?Carolina?State?University?(NCSU23/NCSU37)、改良的Chatot,?Ziomek,?Bavister?培養液、Beltsville?embryo?culture?medium?(BECM)培養液和PZM系列(PZM-3/PZM-?4/PZM-5)培養液。其中NCSU23是公認的這其中最成功的培養液，它基本能滿足其發育至囊胚的代謝和營養需要。然而這些經體外培養后的胚胎經胚胎移植后，其妊娠率和窩均產仔數均很低，發育至囊胚的細胞數也顯著低于體內胚胎，我們還需要對體外培養液進行改進，以提高豬早期胚胎體外生產效率。

發明內容

發明人經大量深入研究，在NCSU23豬胚胎培養液的基礎上，通過在豬早期胚胎（即豬孵化囊胚前的胚胎）發育前期階段和后期階段添加及刪減某些營養物質或抗氧化劑，大大提高了豬克隆胚胎和孤雌激活胚胎的體外發育效果。兩種胚胎利用本發明的豬早期胚胎發育前期培養液及后期培養液培養后，囊胚率和內細胞團數均要顯著高于NCSU23和NCSU37。

本發明的目的之一在于提供一種pH值為7.3±0.02的豬早期胚胎發育前期培養液，用于豬早期胚胎發育的前期培養，即前60h的培養，具體成份包括：NaCl、KCl、KH₂PO₄、MgSO₄、NaHCO₃、BSA（牛血清白蛋白），其特征在于還包括：乳酸鈣和丙酮酸鈉。研究表明，高濃度的葡萄糖對豬4細胞前的胚胎有抑制其體外發育作用，而在4細胞以后，一定濃度的葡萄糖則可以促進囊胚的形成。本發明中，NaCl的主要作用是維持整個培養液的滲透壓（當然其他物質也提供滲透壓）；KCL為K離子主要來源（KH₂PO₄也部分提供K離子），且生理狀態下Na離子和K離子通常維持在一定比例，通常為20:1。KH₂PO₄和NaHCO₃為一對緩沖體系，主要起維持培養液pH值的作用。BSA起到營養細胞的作用。在豬早期胚胎發育的前期用低濃度的Na-pyruvate（丙酮酸鈉）和Ca-(lactate)₂·5H₂O（乳酸鈣）代替葡萄糖作為能量物質，60h后恢復葡萄糖，部分提高了胚胎的發育效果。同時乳酸鈣中的鈣代替氯化鈣作為鈣源。