[發明專利]一種高效誘導人類體細胞重編程為多潛能干細胞的方法

有效

• 申請號: 201010593844.3
• 申請日: 2010-12-17
• 公開（公告）號: CN102093981A
• 公開（公告）日: 2011-06-15
• 發明（設計）人: 李陶;陳夢飛;許笛;吳捷;何毅欣;徐亮;周欣;安鐘姚;周向軍;姜舒;胡祥
• 申請（專利權）人: 深圳市北科生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識產權事務所 44248
• 代理人: 胡吉科

1.一種誘導體細胞重編程為多潛能干細胞的方法：包括以下步驟：

A.用含甲狀腺激素T3或T4的培養基培養體細胞2-4天；

B.將核重編程因子加入到體細胞培養液中與體細胞接觸，繼續培養，挑選形態類似胚胎干細胞的克隆傳代培養，通過篩選符合胚胎干細胞特性的細胞克隆，得到多潛能干細胞；所述核重編程因子以DNA、mRNA或蛋白質形式與體細胞接觸。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟A所述甲狀腺激素T3或T4濃度為10^-10-10^-7mol/L；步驟A所述體細胞為靈長類動物的皮膚成纖維細胞、粘膜上皮細胞、淋巴細胞、毛囊細胞、脂肪間充質干細胞，臍帶間充質干細胞，骨髓間充質干細胞。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟B所述將核重編程因子加入到體細胞培養液中與體細胞接觸后，需繼續用終濃度為10^-10-10^-7mol/L的甲狀腺激素T3或T4的培養基培養5-8天。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟B所述核重編程因子包含Oct3/4和Sox2、Sox1中的一種。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述核重編程因子還包含Klf4，c-Myc，Nanog，Lin28中的至少一種。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：步驟B所述核重編程因子以DNA形式與體細胞接觸；所述DNA為帶有相應核重編程因子編碼序列的載體；所述載體為病毒載體或質粒。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：所述病毒載體為逆轉錄病毒載體、慢病毒載體或腺病毒載體。

8.根據權利要求1至7任一所述的方法，其特征在于：步驟B具體為將核重編程因子加入到體細胞培養液中與體細胞接觸后，繼續培養18-30小時，然后換20%FBS-DMEM培養，3-5天后傳代至飼養層細胞繼續培養3-5天，最后換ESC培養基培養3-5天即可得到多潛能干細胞。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于：將核重編程因子加入到體細胞培養液中與體細胞接觸的同時補充加入新鮮培養液；所述飼養層細胞為用絲裂霉素處理使其失去增殖能力的胚胎期13.5天的小鼠成纖維細胞。

10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于：所述ESC培養基是由knockout?DMEM或DMEM/F12、5-100ng/L堿性成纖維細胞生長因子、2mmol/L?L-glutamine、0.1mmol/L?b-巰基乙醇、0.1mmol/L非必需氨基酸、20%血清替代物、5-25ug/mL抗支原體藥物plasmocin以及抗生素組成的培養基。