[發(fā)明專利]降解赤霉病菌毒素基因產(chǎn)物檢測

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010593222.0
• 申請日: 2010-12-17
• 公開（公告）號: CN102156192A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 薛保國;楊麗榮;雷振生;全鑫;孫虎;宋玉立;閆海霞;魯傳濤;郭松景;趙獻(xiàn)林;劉紅彥;吳坤;何文蘭;吳政卿;王恒亮;曹岳恩;武超;王亞南;馬雪皎;王愛平;劉明源
• 申請（專利權(quán)）人: 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531;G01N33/543
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• 代理人: 暫無信息

1.一種降解赤霉病菌毒素的Tri101基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測方法，其特征在于，以兔抗GST-Tri101抗體作為一抗，羊抗兔IgG-HRP為二抗，與含有Tri101蛋白的待檢測物進(jìn)行Western?blot分析；所述兔抗GST-Tri101抗體的制備，是將純化的GST-Tri101融合蛋白作為抗原，注射健康新西蘭大白兔制備出兔抗GST-Tri101抗體，其中，

(1)GST-Tri101融合蛋白抗血清的制備包括以下步驟：

①選取14-16周齡的健康新西蘭大白兔，每次注射180μg左右純化的GST-Tri101融合蛋白抗原，在免疫前，從兔耳抽取血樣，作為陰性對照；

②GST-Tri101融合蛋白抗原500μL，加500μL福氏完全佐劑乳化，皮下多點(diǎn)注射免疫；

③3周后，GST-Tri101融合蛋白抗原500μL，加500μL福氏不完全佐劑乳化，腿部肌肉多點(diǎn)注射免疫；

④2周后，500μL?GST-Tri101融合蛋白抗原免疫；

⑤1周后，再次用1mL?GST-Tri101融合蛋白抗原加強(qiáng)免疫，同時，從兔耳抽血樣，采用間接ELISA進(jìn)行多抗血清效價測定；

⑥1周后，殺兔收集血液，收集的血液置室溫下凝固；

⑦將凝固的血液放入37℃溫箱內(nèi)半小時，再置4℃冰箱過夜，使血塊收縮，抗血清析出；

⑧吸出抗血清，3000rpm離心10min，吸上清液分裝，-70℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)GST-Tri101融合蛋白抗血清的純化包括以下步驟：

①用pH值為7.4的PBS溶液將血清稀釋2倍；

②攪拌下逐滴加入飽和硫酸銨溶液，其pH值為7.4，使其飽和度達(dá)到50％，4℃靜置2小時以上；

③在4℃條件下，以12000rpm離心20min，將其沉淀溶于2倍的PBS溶液中；

④加入飽和硫酸銨溶液，其pH值為7.4至溶液飽和度達(dá)到33％，4℃靜置2小時以上；

⑤在4℃條件下，以12000rpm離心20min，沉淀用少量的PBS溶液溶解；

⑥在4℃條件下，在大于20倍體積的PBS溶液中透析24小時，中間更換透析液3次；

⑦收集透析液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，GST-Tri101融合蛋白的制備過程中，通過SDS-PAGE檢測蛋白是否表達(dá)，待SDS-PAGE結(jié)束后，用250mM?KCl染膠，就可見白色的蛋白條帶；割取含目的條帶的凝膠，回收GST-Tri101融合蛋白。

3.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，用于檢測感赤霉病小麥中Tri101基因的表達(dá)。

4.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，兔抗GST-Tri101抗體為多克隆抗體。

5.如權(quán)利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于，兔抗GST-Tri101抗體經(jīng)ELISA法測定抗體效價為1∶256000，制備的抗體與原核細(xì)胞體外表達(dá)的Tri101蛋白可以特異性結(jié)合。

6.如權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，Tri101蛋白是pGEX-4T2/Tri101轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生的約75.45kD的蛋白。

7.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，羊抗兔IgG-HRP為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG酶標(biāo)抗體。

8.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，首先將蛋白從SDS-PAGE膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后用封閉液封閉2小時，接著用PBST+5％脫脂奶粉+純化后抗體2μL，室溫反應(yīng)1小時，用PBST洗3～6次，10min/次，加入PBST和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔的二抗，室溫反應(yīng)1小時，用PBS洗膜3次，10min/次；最后將PVDF膜置于含有DAB的顯色液中至條帶清晰，將膜放入蒸餾水終止顯色反應(yīng)。

9.如權(quán)利要求1所述檢測方法在含有或可能含有Tri101蛋白的小麥、玉米等待檢測糧食作物和或其加工的產(chǎn)品的應(yīng)用。