[發明專利]一種微生物及其分離、培養方法與應用

無效

• 申請號: 201010592262.3
• 申請日: 2010-12-16
• 公開（公告）號: CN102154146A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 張洪斌;劉明艷;胡雪芹;陳志斌
• 申請（專利權）人: 合肥工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/02;A01P7/04;C12R1/465
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責任公司 34101
• 代理人: 何梅生

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，具體地說是一種微生物及其分離、培養方法與應用。

背景技術

據聯合國糧農組織調查資料介紹，全球每年被病蟲害奪去的谷物占收成的20％-30％，由此造成的經濟損失達1200億美元。世界各國為了對付日益復雜的病蟲害，每年要生產各種化學農藥200多萬噸，這些化學農藥相當一部分是高毒高殘留，毫無疑問生物農藥的崛起成為現代農藥的發展趨勢。我國是一個農業大國，每年由農作物病蟲害造成的經濟損失巨大。而且，由于化學農藥的濫用，人畜中毒事件頻頻發生，生態環境遭到了嚴重破壞，環境污染日趨嚴重；另一方面日本、歐盟等國相繼提高了農殘限制標準，對于我國農產品的出口提出了更高的要求。因此利用現代生物技術研究高效低毒的生物農藥，控制農作物的病蟲害、降低農殘對我國有重要意義。

發明內容

本發明的目的是針對目前尚無有效地拮抗性微生物用于防治鱗翅目昆蟲病害，而提供一種從土壤中篩選培養出特定的拮抗性微生物來防治昆蟲病害，本發明還提供了該微生物的分離、培養方法與應用。

昆蟲病害的生物防治，就是利用拮抗性微生物來防治昆蟲的病害。為了有效地分離篩選到能對上述各種鱗翅目昆蟲病害有抑制作用的生防菌株，本發明采取了平板透明圈法和DNS比色法篩選到鏈霉菌Streptomyces?sp.A0901，該菌種已于2010年11月25日在中國專利局指定的保藏單位(中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，郵編：100101)保藏，其保藏登記號為CGMCC?NO?4367。

本發明的微生物A0901菌株具有下述性質：

菌體形態特征：

在固體高氏一號培養基(配方：可溶性淀粉2g，KNO₃?0.1g，K₂HPO₄·3H₂O?0.05g，MgSO₄·7H₂O?0.05g，FeSO₄·7H₂O?0.001g，瓊脂1.8g，H₂O?100ml，pH?7.2～7.5，下同)上29℃培養2天，菌落擴散生長，表面光滑，菌落邊緣產孢區常排成同心螺紋，產孢區最初成白色，逐漸變成灰白色，繼而呈現灰褐色；4天后形成局限突起的灰褐色菌落團，菌落背面高氏一號培養物暗黑色，老的培養基散發一股土腥氣。

其基絲彎曲幅度較大，發達，氣絲少彎曲，孢子鏈無螺旋，分支較短。

16S?rDNA基因序列

用27f與1492r為引物進行擴增出該菌株的16S?rDNA基因的部分序列，測序結果在?http://www.ncbi.nlm.nih.gov/網站上用blast程序與已登錄細菌菌株的16S?rDNA基因序列進行比較，結果表明與鏈霉菌的相似性最高，達到99％。

本發明微生物的培養方法是：

先采用固體高氏一號培養基，將上述菌在試管斜面培養基上接種后，28-30℃下活化培養，兩天后，再采用液體高氏一號培養基，將試管中鏈霉菌接種在錐形瓶高氏一號液體培養基中29℃恒溫生化培養箱中培養48h。

上述微生物的液體發酵制備方法按以下步驟進行：

1)試管培養基：采用滅菌固體高氏一號培養基，將A0901菌接種在試管培養基上，28-30℃下培養44-48h；

2)擴大培養基：采用滅菌液體高氏一號培養基，將試管培養基中A0901菌接種在錐形瓶中，置于搖床上28-30℃下培養58-65h小時作為種子液；

3)液體發酵培養基：采用液體高氏一號培養液，121℃高壓滅菌20min左右，待滅菌培養液冷卻至29℃時，將錐形瓶中的培養物按6-8％(v/v)的比例接入發酵液，29℃下培養120h小時得到相應拮抗菌的菌漿。

該微生物的分離方法是：在99ml無菌水中加入1g土樣(土樣取自合肥豐樂園西瓜田地)制備土壤稀釋液，在高氏一號培養基內加入50mg/ml制霉素溶液(100ml加入100μl)，倒入培養皿中，靜置冷卻成平板。采用稀釋涂布法將稀釋后的土壤溶液分別涂布于平板上，然后倒置于29℃恒溫生化培養箱中培養，待菌長出后，用接種針在另一滅菌固體高氏一號培養基上進行劃線分離，經純化培養后得到放線菌菌株。