[發(fā)明專利]用一粒稻谷鑒定秈稻和粳稻的分子標(biāo)記方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010591787.5
• 申請(qǐng)日: 2010-12-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102031253A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-04-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧寶榮;蔡星星;劉蘋(píng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;盛志范

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物類型鑒別技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在一粒水稻種子（或稻米）中提取DNA，并鑒定其秈稻和粳稻特性的方法。

技術(shù)背景

栽培稻（Oryza?sativa?L.）是我國(guó)重要的三大糧食作物之一，在我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有舉足輕重地位。栽培稻起源于我國(guó)，已有8000多年的栽培歷史，目前廣泛種植于全球。在栽培稻的栽培和馴化過(guò)程中，由于適應(yīng)不同的生態(tài)環(huán)境，產(chǎn)生了顯著的秈稻和粳稻遺傳分化。典型的秈稻和典型的粳稻之間已經(jīng)形成了明顯的生殖隔離，故通常將秈稻和粳稻分成兩個(gè)亞種：秈稻亞種（Oryza?sativa?subsp.?indica）和粳稻亞種（Oryza?sativa?subsp.?japonica）。秈稻和粳稻不僅在形態(tài)、生理和生化性狀方面產(chǎn)生了較大的差異，而且也形成了不同的稻米品質(zhì)和口感品味等特點(diǎn)。稻米的不同消費(fèi)人群對(duì)于秈稻或粳稻的喜好是不同的，如北方人更偏重選擇粳稻，這就造成了不同類型稻米在價(jià)格上有較大差異。同時(shí)在育種中，由于秈稻和粳稻的遺傳分化以及上述特征特性，進(jìn)行秈稻和粳稻的亞種間有性雜交，可以產(chǎn)生豐富的遺傳變異類型而培育出優(yōu)異的水稻品種；秈稻和粳稻的亞種間雜種優(yōu)勢(shì)，在雜交稻的培育中也具有重要的價(jià)值。因此，對(duì)于秈稻和粳稻的鑒定，不僅可以確定特定稻米的商品價(jià)值，而且在水稻育種中也具有重要的實(shí)踐意義。

雖然秈稻和粳稻的準(zhǔn)確鑒定極為重要，但是一直以來(lái)，對(duì)秈稻和粳稻的準(zhǔn)確鑒定都存在較大的問(wèn)題。傳統(tǒng)鑒定秈、粳稻的方法主要依賴于形態(tài)性狀變異(如：株高，株型等)以及生理生化功能差異。目前用來(lái)鑒定秈稻和粳稻最常用的方法是以形態(tài)鑒定為基礎(chǔ)的“程氏指數(shù)法”，（包括6個(gè)性狀：稃毛、酚反應(yīng)、穗節(jié)長(zhǎng)、稻殼色、葉毛和谷粒長(zhǎng)寬比）。這個(gè)方法的最大缺點(diǎn)：1）由于形態(tài)性狀受環(huán)境的影響較大而導(dǎo)致檢測(cè)的不準(zhǔn)確；2）形態(tài)測(cè)量必須要栽種被測(cè)水稻樣品，從播種到成熟一般需要3-5個(gè)月，耗時(shí)長(zhǎng)；3）形態(tài)測(cè)量需要一定的樣品群體，故需要較多的水稻樣品；大大影響了秈稻和粳稻鑒定的效率。專利“利用水稻DNA插入或缺失分子標(biāo)記鑒定秈稻和粳稻的方法”大大提高了秈稻和粳稻鑒定的準(zhǔn)確性和效率。但是，水稻DNA的提取通常是以新鮮葉片來(lái)進(jìn)行，需要將稻種進(jìn)行萌發(fā)，形成幼苗，1周甚至10天以后才能提取DNA，耗時(shí)較長(zhǎng)。對(duì)于不能萌發(fā)出苗的種子，無(wú)法提取DNA。以一粒稻米中提取的DNA為模板，結(jié)合InDel分子標(biāo)記方法，能更快速和高效地確定稻米樣品的秈、粳特性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種僅用一粒稻谷（或稻米）提取DNA，并利用InDel分子標(biāo)記電泳和分析，快速和精確鑒定稻谷樣品秈稻和粳稻特性的方法。

本發(fā)明提出的一粒稻谷鑒定水稻的秈稻和粳稻特性方法，是一種利用一粒稻谷（或稻米）中提取的微量DNA為模板、插入或缺失（InDel）分子標(biāo)記以及瓊脂糖電泳技術(shù)鑒定水稻品種的方法。具體來(lái)說(shuō)是以一粒稻谷中提取的DNA為模板，利用水稻亞種間DNA序列的特異性差異InDel片段，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物組合以及衍生物，對(duì)秈稻型等位基因（I）和粳稻性等位基因（J）的頻率（F_i或F_j）進(jìn)行計(jì)算，并根據(jù)這些頻率的值（0-100%）來(lái)確定秈稻和粳稻的方法。

本發(fā)明用于提取一粒稻米中微量DNA樣本的方法，具體步驟如下：

（1）取一粒稻米，研磨成粉末，加入750μL?CTAB?提取緩沖液；

（2）緩沖液經(jīng)氯仿/異戊醇萃取后，在7000~13000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心；

（3）上清液中加入等體積沉淀緩沖液，于-20℃放置30分鐘，按步驟（2）離心；所述緩沖液配方可選為：0.5~1.5%?CTAB，40~60?mmol/L?Tris-HCl?pH7.8~8.5，9.5~10.5?mmol/L?EDTA??pH7.8~8.5；

（4）沉淀物中加入500μL純化液，重復(fù)步驟（2）；所述純化液配方可選為：9.5~10.5?mmol/L?Tris-HCl??pH7.8~8.5，0.8~1.2?mmol/L?EDTA??pH7.8~8.5，0.8-1.2?mol/L?NaCl；

（5）上清液加入無(wú)水乙醇，-20℃沉淀DNA，按步驟（2）離心，沉淀物經(jīng)70%乙醇漂洗、離心后烘干。?

本發(fā)明用于鑒定秈稻和粳稻的InDel?特異引物一共有40對(duì)，具體如下表1：