[發明專利]一種親和篩選菠蘿蛋白酶的親和配基的方法

無效

• 申請號: 201010591612.4
• 申請日: 2010-12-16
• 公開（公告）號: CN102121043A
• 公開（公告）日: 2011-07-13
• 發明（設計）人: 朱利民;陳天翔;聶華麗;汪雯
• 申請（專利權）人: 東華大學
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37;G01N33/573
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達;謝文凱

1.一種親和篩選菠蘿蛋白酶的親和配基的方法，包括：

(1)酶標板包被100～300μl菠蘿蛋白酶溶液，4℃輕微震蕩，孵育12-24h，之后沖洗包被液，加滿封阻液，0～4℃靜置1～2h，完成后去除封阻液，用TBST緩沖液迅速洗酶標板2～10次；噬菌體7肽庫以5～10倍稀釋度加入上述酶標板的酶標孔中，搖動1～2h，TBST緩沖液迅速洗酶標板2～10次，用50～100μg/ml游離菠蘿蛋白酶分子TBS洗脫液競爭性洗脫吸附在固相酶標板上的噬菌體，室溫搖動1～2h，洗脫下來的噬菌體作滴度測試；

(2)挑取ER2738菌株培養于LB-Tet培養液中，25～37℃180～200rpm振蕩培養12-24h，之后用不加抗生素Tet的LB培養液1∶50～1∶100稀釋并再次培養待用，步驟(1)噬菌體洗脫液定量加入至上述大腸桿菌菌液中，25～37℃，60～100rpm感染1～2h，0～4℃，離心10～20min，去上清，菌體重懸至100～200ml?LB培養液中培養8～14h，取培養后的菌液0～4℃，離心10～20min，取上清，加入體積比為1∶3～1∶6的聚乙二醇和氯化鈉，震蕩混勻后冰置1～2h，在0～4℃，8000～15000rpm離心10～20min去上清，沉淀物重懸于1～2ml?TBS溶液，再加體積比為1∶3～1∶6的聚乙二醇和氯化鈉溶液進行再沉淀，冰置1～2h后，0～4℃，8000～12000rpm離心10～20min，棄上清，再快速離心移去殘余上清液，沉淀重懸于100～200μl?TBS，0.01～0.02％NaN₃中，得擴增后的噬菌液；

(3)將上述擴增后的噬菌液分別用TBS緩沖液稀釋10～10³倍，噬菌液加入到大腸桿菌菌液，快速震蕩混勻，室溫溫育2～5min，然后將感染的菌液注入40～50℃的頂層瓊脂試管中，快速震蕩混勻并立即傾注于25～37℃預溫的LB/IPTG/Xgal平板上，均勻鋪開，25～37℃倒置培養12-24h，之后計數平板；

(4)挑取上述LB-IPTG/Xgal平板上藍色噬菌斑10～20個分別裝入上述1～2ml?ER2738菌液中，25～37℃180～220rpm震蕩培養4～5h，離心后取上清液即得單克隆擴增液；

(5)100～300μl?pH?8.6菠蘿蛋白酶0～4℃包被12-24h，吸出包被液，加滿封阻液，25～37℃靜置1～2h，完成后吸出封閉液，用TBST快速洗板2～10次，每孔加入100～300μlTBST，每排第二孔加入10～20μl的單克隆擴增液，并稀釋至12孔，25～37℃緩慢震蕩1～2h，甩出單克隆擴增液，TBST洗滌6～10次后，每孔加入100～300ul抗fd噬菌體生物素復合物，輕輕混勻20～30sec，封板后25～37℃溫育1～2h，TBST再次洗滌6～10次，每孔加入100～300ul抗生物素辣根過氧化物酶復合物，輕輕混勻20～30sec，封板，25～37℃同樣溫育1～2h，TBST再次洗板6～10次，每孔加入100～300ul鄰苯二胺顯色液，輕輕混勻5～10sec，25～37℃暗處顯色0.2～1h，顯色后每孔加入100～300μl?1～2MH₂SO₄終止液，輕輕混勻20～30sec；20～30min內測OD值；

(6)挑取步驟(5)中的ELISA陽性單克隆噬菌體以-96引物進行測序，解讀7肽氨基酸排列序列。

2.根據權利要求1所述的一種親和篩選菠蘿蛋白酶的親和配基的方法，其特征在于：所述步驟(1)中的酶標板為96孔酶標板。

3.根據權利要求1所述的一種親和篩選菠蘿蛋白酶的親和配基的方法，其特征在于：所述步驟(2)中洗脫下來的噬菌液5～10μl用作滴度測試，待用的宿主大腸桿菌ER2738的菌種濃度為OD?A₆₀₀＝0.2～0.5。

4.根據權利要求1所述的一種親和篩選菠蘿蛋白酶的親和配基的方法，其特征在于：所述步驟(2)中的噬菌體擴增計算的有效值為每個平板含有噬菌斑1～100個。

5.根據權利要求1所述的一種親和篩選菠蘿蛋白酶的親和配基的方法，其特征在于：所述步驟(3)中的滴度測試中，噬菌液體積為5～10μl，大腸桿菌ER2738的體積為100～200μl。