[發明專利]一種駑巴貝斯蟲病免疫印跡檢測方法及試劑盒制備

無效

• 申請號: 201010591331.9
• 申請日: 2010-12-16
• 公開（公告）號: CN102062776A
• 公開（公告）日: 2011-05-18
• 發明（設計）人: 王玉玲;左鋒;王建華;柴宏森;王乃福;趙林立;侯艷梅;趙祥平
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國天津出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;C12N1/10
• 代理公司: 天津市鼎和專利商標代理有限公司 12101
• 代理人: 李鳳

技術領域

本發明涉及一種駑巴貝斯蟲病免疫印跡檢測方法及試劑盒制備方法，特別涉及一種使用免疫印跡試驗檢測駑巴貝斯蟲病（Babesia?caballi）血清抗體的方法及其診斷試劑盒的制備方法，屬于馬屬動物血液原蟲病檢測領域。

背景技術

駑巴貝斯蟲病(Babesia?caballi)是由駑巴貝斯蟲寄生于馬屬動物的紅細胞內所引起的血液原蟲病，臨床表現為高熱、貧血、黃疸、水腫等癥狀。最急性病例比較少見，到發現時病馬已死亡或瀕死。該病在世界分布廣泛，在歐洲，法國、意大利及俄羅斯南部和東部大部分地區，直至北緯58度地區，都有駑巴貝斯蟲病流行的報道。法國南部駑巴貝斯蟲病血清學調查流行率為11.3%，在南美洲、拉丁美洲、非洲、亞洲都有駑巴貝斯蟲病的報道。巴西駑巴貝斯蟲流行高達59.4%?至?65.5%??，特立尼達島也有駑巴貝斯蟲病流行的報道。尼加拉瓜駑巴貝斯蟲陽性率為41%，南非駑巴貝斯蟲病血清學調查陽性率高達61.9%，蒙古駑巴貝斯蟲病分布廣泛，血清學調查陽性動物達40.1%。我國駑巴貝斯蟲病主要流行于東北、內蒙古東部及青海等地，在我國有14個省區都曾有該病散發或地方性流行的報道。甘肅、黑龍江、吉林、新疆也是駑巴貝斯蟲病流行地區。

馬匹耐過駑巴貝斯蟲病后，帶蟲免疫可持續達4年。疫區的馬匹由于經常遭受蜱的叮咬，反復感染，因此一般不發病或只表現輕微癥狀而耐過，但由外地進入疫區的新馬及新生的幼駒由于沒有這種免疫性，容易發病。在沒有疫情但有蜱類活動的地區，對外來馬匹要嚴格進行駑巴貝斯蟲病的檢疫，防止帶蟲馬進入。

由于該病在世界范圍內分布廣泛，為嚴重傳播性疾病，難以根除，因此各國均把該病列為重要監測的馬病之一，因此病對國際貿易產生重要影響，世界動物衛生組織（OIE）將該病列為對國際貿易產生重要影響的疾病，我國農業部將其列為二類動物傳染病。在國際貿易中，大多數國家簽署的雙邊檢疫協定中，將該病列為法檢項目。

由于該病感染動物后，常不表現為明顯的臨床癥狀，因此很難從癥狀上診斷。此類疾病主要是通過實驗室檢驗方法進行確診。病原鑒定主要通過血液涂片和PCR，實驗室檢驗方法常采用血清學檢測方法，主要有間接熒光抗體試驗、補體結合試驗、酶聯免疫吸附試驗(世界動物衛生組織(OIE).陸生動物診斷和疫苗手冊[M],?2008:1-2.)。血液涂片法只有動物處于急性感染期才是可行的診斷方法，?PCR目前雖已建立但仍需發展和完善，且PCR因受制于病原核酸的提取，其試驗的敏感性和特異性還有待提高。間接熒光抗體試驗敏感性不強，且容易受操作者主觀因素影響結果判斷。補體結合試驗現為許多國家推薦的檢驗方法，但此法會受到抗補體因素的影響而不能判斷樣品的實驗結果，酶聯免疫吸附試驗雖然操作簡便，敏感性較強，但易發生交叉反應，出現假陽性結果。探討研究新的檢測方法是科學技術發展的必由之路，也是疾病檢測技術發展的要求。

????免疫印跡法是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。由于免疫印跡具有?SDS-PAGE?的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋白分析的一種常規技術，但多用于鑒定某種蛋白，將其用于疫病檢測方面的研究并不多。?

國內用免疫印跡法檢測動物疫病的研究很少，沒有關于駑巴貝斯蟲病免疫印跡檢測方法的研究報道。

發明內容

本發明人進行了大量的實驗工作，終于建立了一種駑巴貝斯蟲病免疫印跡診斷試劑盒的制備方法。本發明采集健康小型馬紅細胞體外培養駑巴貝斯蟲，經過擴大培養，將獲得的培養物制成免疫印跡診斷抗原，并經實驗室感染馬匹獲得駑巴貝斯蟲抗體陽性對照血清。?同時，在獲得診斷抗原和陽性對照血清的基礎上建立了駑巴貝斯蟲病免疫印跡檢測方法。

本發明目的是提供一種駑巴貝斯蟲病免疫印跡診斷試劑盒及其制備方法，本發明目的通過以下技術方案實現：

（1）制備蟲體培養用紅細胞：

無菌采集健康馬血，離心處理后用VYM’s緩沖液洗滌、懸浮得到；

離心條件：4℃-8℃，低速，?30±5?min；

（2）建立及擴大駑巴貝斯蟲體外培養

無菌采集感染駑巴貝斯蟲病馬的抗凝血，經離心處理，用3x?VYM’s緩沖液洗滌、懸浮獲得染蟲紅細胞后，采用HL-1組織培養液培養，當染蟲率達到1.5%-2%時即進行分代培養；之后每當染蟲率達到2%或以上時即擴大培養；