[發明專利]基于瓊脂糖凝膠變性復性及生物素親和吸附的自發突變基因的分離檢測方法

無效

• 申請號: 201010591216.1
• 申請日: 2010-12-15
• 公開（公告）號: CN102094091A
• 公開（公告）日: 2011-06-15
• 發明（設計）人: 李春雨;易干軍;孫清明
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院果樹研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種基于瓊脂糖凝膠變性復性及生物素親和吸附的自發突變基因的分離方法。

背景技術

香蕉是僅次于水稻、小麥和玉米的全世界第四大糧食作物。據聯合國糧農組織(FAO)統計，近10年來，世界香蕉種植面積總體上呈增長的趨勢，?2007年種植面積為6615.75萬畝，產量達到8126.34萬噸，創歷史新高。2007年中國香蕉收獲面積為458.25萬畝，列世界第5位；總產量732.50萬噸，排世界第2位。但是該產業的發展正遭受到枯萎病的毀滅性威脅，病原菌為尖孢鐮刀菌古巴專化型(Fusarium?oxysporum?f.sp.?cubense)。病原菌從香蕉幼根或根部損傷部位侵入球莖、假莖，引起維管束褐變和系統侵染,?造成植株整株枯死。病原菌屬于土傳真菌，在土壤中可以存活長達30年。

香蕉枯萎病已經造成相當大的危害。上個世紀，病原菌1號（Foc1）生理小種破環了中美洲數千個香蕉園，現在世界范圍內對香蕉產業的發展造成毀滅性的威脅為4號（Foc4）生理小種，已經導致我國臺灣地區香蕉種植面積銳減為原來的十分之一。大陸地區種植的香（大）蕉中，90%以上為易感Foc4的香牙蕉品種，2003年發病面積已經達到2萬公頃，并有迅速蔓延的趨勢。

目前還沒有找到一種有效的防治香蕉枯萎病的化學藥劑,?香蕉只能在不含病菌的土壤上生長。抗病育種是當前解決香蕉枯萎病比較有希望的途徑。現在生產上已經篩選到一些抗病突變體，如果能夠克隆這些突變基因，再進一步轉化到一些優良品種中，就可以控制該病害。?

對于這樣的自然突變，目的基因的染色體位置、序列以及產物的序列和功能等信息都是未知的，克隆該類基因的一個方法是圖位克隆法，即先構建雜交群體，進行染色體定位，最后通過染色體步行法分離該基因。但是圖位克隆法較為適合那些生育周期比較短、有飽和遺傳連鎖圖譜、染色體比較小、基因組中重復序列不多、已經構建了成熟的遺傳轉化系統的物種。香蕉顯然不具備這些條件，雖然現已構建了一些群體，但其遺傳圖譜的飽和度還比較低，分子標記間的平均距離在10cM以上，較長的童期影響了F2代群體的構建，香蕉基因組大小為600M以上，重復序列多影響了染色體步行的進行。所以利用圖位克隆法分離該突變基因還存在很大的困難。另外一個方法是表型克隆法，僅僅根據有關基因的突變產生的表型變化就直接分離該基因的克隆策略，而不必事先探知其生化功能或圖譜定位，甚至也不需假設基因的數目或其相互作用的方式，即將表型與基因結構或基因表達的特征聯系起來，從而分離特定表型相關基因。但是現有的表型克隆方法，如基因組扣除法，由于不能解決酶切片段間的特異性雜交問題，從而限制了它們的進一步應用。

發明內容

本發明的目的在針對現有技術的不足，提供一種利用MutS蛋白在基因組范圍內檢測單核苷酸多態性或小的插入和缺失的方法。

本發明通過以下技術方案實現上述目的：

發明提供了一種突變基因的識別和分離方法，包括以下步驟：用生物素標記野生型DNA片段，將生物素標記的野生型DNA片段與待檢測的DNA片段混合，進行變性和復性；此時含有突變位點的DNA片段因為沒有相同遷移率的生物素標記野生型DNA片段與之雜交而無法形成異源雙鏈DNA分子，而裸露在外；而不含有突變位點DNA片段與相應的生物素標記野生型DNA片段雜交，形成異源雙鏈DNA分子；再采用鏈霉親和素磁珠吸附，將帶有生物素標記的分子吸附回收，實現不帶有生物素的含有突變位點的DNA片段的分離。

在將生物素標記的野生型DNA片段與待檢測的DNA片段混合時，需要采用過量的野生型DNA片段與少量的待檢測的DNA片段混合，兩者摩爾比例為20-50:1。

被分離出來的突變位點的DNA片段，可以根據兩端連接的接頭序列，而被擴增出來，可以根據序列分析其突變的機理。

上述的野生型DNA片段與待檢測的DNA片段，是將野生型和突變體基因組DNA分別提取并采用限制性內切酶進行消化，并進一步連接接頭獲得的。該限制性內切酶采用可以利用識別4或6堿基的，并且能夠產生粘性末端的限制性內切酶，以便連接接頭。

將野生型和突變體基因組酶切后獲得的DNA片段分別連接接頭，所采用的接頭均為SEQ?ID?NO:1（5‘-CATGCTTGTAGACTCACA-3’）和SEQ?ID?NO:2（3’-ACGAACATCTGAGTGTGC-5’），不同的是其中野生型DNA片段連接的是經生物素標記的接頭，而突變體DNA片段連接的是經生物素標記的接頭。