[發明專利]一種大豆遺傳轉化方法

無效

• 申請號: 201010590528.0
• 申請日: 2010-12-09
• 公開（公告）號: CN102127565A
• 公開（公告）日: 2011-07-20
• 發明（設計）人: 王光霞;李國婧;萬永青;王瑞剛
• 申請（專利權）人: 內蒙古農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 呼和浩特北方科力專利代理有限公司 15100
• 代理人: 王社

技術領域

本發明涉及一種大豆遺傳轉化方法，具體指對大豆子葉節進行遺傳轉化并高效再生的方法。

背景技術

大豆(Glycine?max(L.)Merrill.)屬于豆科、蝶形花亞科、大豆屬的二倍體(2＝40)植物，在世界各國廣泛種植，是世界上重要的糧食作物和經濟作物，也是食用油和植物蛋白的主要來源。由于受到各種病害、蟲害以及各種非生物逆境的影響，大豆的品質和產量難以滿足人們的需求，通過基因工程手段改良大豆作物具有重要的意義。雖然目前轉基因大豆已在全球大規模種植，但大豆遺傳轉化一直是限制大豆轉基因研究的主要障礙，大豆再生體系的建立與遺傳轉化目前仍然很不完善，而植物基因轉化的成功，有賴于建立良好的轉基因體系。大豆再生體系的研究是大豆遺傳轉化研究的一個重要組成部分，為提高轉化效率、縮短實驗周期、解決大豆遺傳轉化中的嵌合體問題，國內外研究者對不同途徑的大豆再生體系進行了研究和優化。大豆組織培養自上世紀50年代開始，其再生和遺傳轉化雖然已有很多年，并且建立起幾種轉化途徑，可是都沒有獲得實質性的突破。在這些研究工作中，子葉節已經被國內外學者公認是大豆遺傳轉化的首選外植體。子葉節作為外植體雖有許多優點，但也存在著外植體較大、不同大豆基因型再生頻率差異較大、再生時間長、篩選難度較大等缺點。因此，建立一套高效的子葉節再生體系及遺傳轉化方法有重要意義。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種大豆遺傳轉化方法，它屬于高效大豆再生體系及遺傳轉化方法，這種方法包括大豆種子滅菌及萌發；農桿菌接種物制備；外植體的制備、侵染與共培養；叢生芽的誘?導；叢生芽的伸長及幼芽生根。

本發明要解決的技術問題由如下方案來實現：一種大豆遺傳轉化方法，本方法利用大豆子葉節為外植體進行農桿菌介導的再生及遺傳轉化培養，其特征在于：

步驟(1)、將大豆種子在附加TDZ的萌發培養基上培養，獲得子葉節外植體；

步驟(2)、利用農桿菌介導對子葉節外植體進行遺傳轉化；

步驟(3)、通過特殊再生體系獲得再生轉基因植株。上述步驟(1)和步驟(3)中融合過程為：

(1)、將大豆種子滅菌，在附加TDZ0.15mg/L的萌發培養基上萌發5天獲得無菌苗，切取子葉節外植體；

(2)、用附加0.4mg/L?6-BA的培養基進行叢生芽誘導及芽伸長，后在附加0.4mg/L?IBA的生根培養基上培養獲得再生植株。

本發明具有如下優點：采用萌發培養基附加TDZ，后期外植體培養只附加特定濃度6-BA的方法實現大豆的再生與遺傳轉化，其培養過程簡單、再生時間較短，是一種新的、快速高效的大豆組織再生及遺傳轉化方法。

附圖說明

圖a種子萌發5天的生長情況

圖b叢生芽誘導10天時的生長情況

圖c芽伸長20天時的生長情況

圖d再生植株

具體實施方式

以下結合具體實施方式對本發明的實驗步驟進行詳細說明：

一、實驗材料

1.植物材料：大豆品種，黑農37

2.菌株與質粒：EHA105-pZY101

二、基本培養基的組成及不同階段的培養基成分

表1MS培養基成分

表2大豆組織培養不同階段培養基的配方

注：以上用量均為1L體積培養基的用量。液體共培養基和固體共培養基的基本成分與芽誘導培養基一致，只是大量元素的用量降低1/10，pH降為5.4；另外，需在液體共培養基中加入乙酰丁香酮40mg，固體共培養基中加入乙酰丁香酮40m?g、L-半胱氨酸400mg、二硫蘇糖醇、154mg、硫代硫酸鈉158mg。除每階段培養基在滅菌前均加0.6％瓊脂。

表3YEP培養基成分及抗菌素濃度

三、大豆種子滅菌及萌發

選取飽滿、健康的種子，洗衣粉清洗干凈后，用75％的酒精表面消毒2min，再用3％的次氯酸鈉消毒20min，然后再用無菌水沖洗5-6次；將14粒滅菌后的種子放入100×25mm的培養皿，種臍向下插入培養基；將5個萌發培養基用保鮮膜較松包裹，保證通氣，(25±1)℃、16h光照/8h黑暗條件下培養5天。

四、農桿菌接種物制備

1.從YEP板上取單克隆農桿菌接種于2ml含適當抗生素的YEP液體培養基，28℃，210-220rpm下過夜培養。