[發明專利]NGAL質粒構建及其融合蛋白的表達無效
| 申請號： | 201010590430.5 | 申請日： | 2010-12-09 |
| 公開（公告）號： | CN102127564A | 公開（公告）日： | 2011-07-20 |
| 發明（設計）人： | 王小中;熊火梅;黃波;肖蕓;劉靜;章海斌 | 申請（專利權）人： | 南昌大學 |
| 主分類號： | C12N15/79 | 分類號： | C12N15/79;C12N15/62;C07K19/00;C12P21/02 |
| 代理公司： | 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115 | 代理人： | 施秀瑾 |
| 地址： | 330031 江西省*** | 國省代碼： | 江西;36 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | ngal 質粒 構建 及其 融合 蛋白 表達 | ||
【權利要求書】：
1.一種NGAL原核表達質粒的構建，其特征：
(1)PCR擴增NGAL的cDNA；
(2)PCR產物與載體pET28a連接，構建重組質粒pET28a-NGAL；
(3)重組質粒pET28a-NGAL轉化大腸桿菌Rosetta?DE3，IPTG誘導蛋白表達，得到NGAL融合蛋白。
2.根據權利要求1所述的重組質粒，其特征在于所述的NGAL為人源NGAL。
3.根據權利要求1所述的重組質粒，其特征在于所述PCR擴增的引物為：
P1：5′-TAGAAAGCTTCACTCAGCCGTCGATACAC-3′，
P2：5′-ATAGGGATCCGAAATCATGCCCCTAGGTC-3′。
4.一種利用權利要求1所述的重組表達生產NGAL融合蛋白的方法，其特征在于包括如下步驟：
(1)篩選高效表達的NGAL蛋白的菌落；
(2)將高效表達的重組菌落用LB培養基培養，IPTG誘導培養獲得含有NGAL融合蛋白的菌液；
(3)離心，往沉淀中加入尿素去除包涵體、室溫搖動、收集融合蛋白；
(4)SDS-PACE鑒定融合蛋白；
(5)切膠純化融合蛋白。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于使用KCL對凝膠進行短暫染色，并參照同樣條件下用考馬斯亮藍R250染色的凝膠，直接從聚丙烯酰胺凝膠上切割下含有NGAL的凝膠條帶。
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