[發明專利]一種便于外源蛋白純化的原核表達載體及構建方法

無效

• 申請號: 201010585352.X
• 申請日: 2010-12-13
• 公開（公告）號: CN102080096A
• 公開（公告）日: 2011-06-01
• 發明（設計）人: 孫懷昌;朱善元;張鑫宇;王健;劉文俊;夏曉莉
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種便于進行外源蛋白表達純化的原核表達載體的構建方法及應用示范。

背景技術

利用原核表達系統體外表達某些特定的蛋白是常用的蛋白生產手段之一，其最大的優點為蛋白產量高、操作簡便，目前已有不少成熟的原核表達系統。傳統的重組蛋白表達與純化通常是在目的蛋白前或后加上特定的標簽（如GST?tag、His?tag等），形成的融合蛋白可借助蛋白標簽進行親和層析，層析柱價格昂貴，使得蛋白純化成本較高，且純化的融合蛋白往往需進行體外裂解去除蛋白標簽后才能獲得很好生物學活性的目的蛋白，常用的裂解方法主要有化學裂解法（如溴化氰、羥胺、BNPS-3-甲基吲哚等）和酶解法（如Xa因子、凝血酶、腸激酶、膠原酶、凝乳酶等）。化學裂解雖價廉、有效，但由于裂解位點特異性低，還可能對目的蛋白產生不必要的修飾，該方法逐漸被酶解法代替，而酶解去除標簽，所用的裂解酶價格不但高，還不可避免地混入目的蛋白中，造成新的污染，使得蛋白純化更加復雜。由于上述原因，最終獲得均一的目的蛋白成本高、周期長，成為制約體外規?；a目的蛋白的瓶頸性問題。

內含肽（Intein）是蛋白質前體內的肽段，在蛋白質成熟過程中通過精準的自我剪切以及兩側序列的拼接，從而實現宿主蛋白的成熟。1987年于Neurospora?crassa液泡ATP酶中最早被發現，1989年以后才被Anraku實驗室逐漸證實其功能，目前已經發現210個以上的內含肽，主要分布在低等真核生物、細菌以及病毒的蛋白質中。隨著對內含肽剪接機制的深入研究，在蛋白質工程及其他生物技術領域表現出越來越廣闊的應用前景，尤其蛋白純化方面，內含肽的發現和應用使得重組蛋白的表達和純化得到大大改進，將其與其它蛋白標簽，如CBD?（Chitin-binding?dimain）融合，可通過親和層析等方法獲得融合蛋白，再利用內含肽的自我剪切功能獲得不含任何外源序列的目的蛋白。目前已構建成功多個內含肽的突變體，可以使得其在特定的條件下（如特定溫度，加入硫醇等）發生一側性剪切，大大提高蛋白純化效率和純度，通過親和層析和內含肽介導的方法，Mills等人成功純化出QACA蛋白，Zhao等人成功純化出綠色熒光蛋白。雖然該方法操作簡便，但仍需要使用價格較高的親和層析柱，這將重組蛋白的生產成本又推至一定的高度。

發明內容

為了解決現有技術的問題，本發明提供一種新的原核表達載體，該載體適用于外源重組蛋白的表達、純化，且純化操作簡便、純化成本低，對重組蛋白的規?；a有著很好的應用前景。

本發明所說的原核表達載體是pET-EM，它是在?pET30a基礎上引入合適的多克隆位點及Mxe?gyrA內含肽、ELP基因，構建得到的新原核表達載體，pET-EM結構如圖1所示。

本發明還公開了pET-EM的構建方法，具體包括以下步驟：

1）用限制性核酸內切酶SapI和BglI酶切載體pET30a，大片段連接后，獲得載體pET30a’；

2）引物設計及基因擴增：

a.根據Mxe?gyrA內含肽設計一對正反向引物P1和P2，

P1：5’-TCCATATGGGTACCCCATGGGCTAGCTCTAGAGGCTCTTCCTGCA

TCACGGGA-3’（SEQ?ID?NO.1）；

P2：5’-TTGATATCAGAGCGTGGCTGACGAACCCG-3’?（SEQ?ID?NO.2）;

其中P1的5'端引入NdeI、KpnI、NcoI、NheI、XbaI、SapI限制性核酸內切酶酶切位點，該些酶切位點構成一多克隆位點，供外源基因的插入；P2的5’端引入EcoRV限制性核酸內切酶酶切位點，為構建質粒提供連接端；

b.在P1、P2的作用下，以pYTB11質粒為模板擴增出Mxe?gyrA基因；

3）將擴增的Mxe?gyrA基因，經?NdeI、EcoRV限制性內切酶酶切后連入載體pET-30a’相應的位點，構建載體pET-M；