[發(fā)明專利]氨(氨離子)的測定方法與氨(氨離子)診斷/測定試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010583800.2
• 申請日: 2010-12-13
• 公開（公告）號: CN102539669A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設計）人: 王爾中
• 申請（專利權）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/52
• 分類號: G01N33/52;G01N21/31;G01N21/33;C12Q1/48;C12Q1/25;C12Q1/26
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明涉及醫(yī)學/食品檢驗測定技術領域，更具體地，本發(fā)明涉及氨(氨離子)診斷/測定方法及其試劑盒。?

背景技術

氨測定的方法有微量擴散法、離子交換法、酶法和氨電極法等。目前應用最多的方法是酶法和基于離子選擇電極的血氨測定儀分析法。?

擴散法是標本堿化后，釋放出NH₃，用酸滴定釋放出的氨，或用Nessler反應形成棕黃色碘化雙汞胺進行比色。這些方法需要堿化，內(nèi)源性的氨形成造成影響，使其準確性和精密度受到影響，目前已很少應用；離子交換法比擴散法更準確，CV為8％～13％；離子選擇電極法是利用NH₃擴散到電極表面，引起電極的pH發(fā)生變化進行測定，該方法的CV為3.5％～4.8％，回收率高。結合具體實際，應以酶法測定為實用。?

檢索中國專利，僅查出87105593.7專利申請公開了一種血氨測定速凍杯，卻未發(fā)現(xiàn)比較理想的血氨測定方法。?

發(fā)明內(nèi)容

[要解決的技術問題]?

本發(fā)明的目的是提供一種氨(氨離子)的測定方法。?

本發(fā)明的另一個目的是提供一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒。?

[技術方案]?

本發(fā)明是通過下述技術方案實現(xiàn)的。?

本發(fā)明的方法是一種采用酶比色法(Enzymatic?Colorimetric?Method)與酶(偶)聯(lián)法(Couple?Reaction)的聯(lián)用技術，利用測定還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處的吸光度變化測定氨(氨離子)的方法。?

本發(fā)明氨(氨離子)測定方法的的技術原理是根據(jù)下述氨激酶、琥珀酸-輔酶A連接酶、輔酶A-谷胱甘肽還原酶的系列催化反應完成：?

氨+腺苷三磷酸?氨激酶?腺苷二磷酸+磷酰胺?

腺苷二磷酸+磷酸根+琥珀酰-輔酶A?琥珀酸-輔酶A連接酶

腺苷三磷酸+琥珀酸+輔酶A?

輔酶A+谷胱甘肽+輔酶?輔酶A-谷胱甘肽還原酶

輔酶A-谷胱甘肽+還原型輔酶?

本發(fā)明的方法利用氨激酶(ammonia?kinase；EC?2.7.3.8)酶(偶)聯(lián)琥珀酸-輔酶A連接酶(succinate-CoA?ligase；EC?6.2.1.5)、輔酶A-谷胱甘肽還原酶(CoA-glutathione?reductase；EC?1.8.1.10)酶促反應比色終點法。氨激酶酶解氨反應產(chǎn)生腺苷二磷酸，再通過(偶)聯(lián)合琥珀酸-輔酶A連接酶、輔酶A-谷胱甘肽還原酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，這樣可以通過測量340nm處吸光度上升的程度，可以測算氨(氨離子)的濃度大小。?

本發(fā)明是通過下述技術方案實現(xiàn)的。?

本發(fā)明涉及一種氨(氨離子)的測定方法。該氨(氨離子)測定方法的步驟如下：?

A、樣品準備：?

A.1標準樣品的制備?

將一定量的氨鹽溶于水或緩沖液中，再將氨濃度調(diào)整到100微摩爾/升，得到的溶液作為標準樣品；

A.2待測樣品的制備?

待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像制備標準樣品一樣溶于水或緩沖液中；?

A.3空白樣品?

所述的水或緩沖液作為空白樣品，其氨(氨離子)濃度為0微摩爾/升；?

B、試劑溶液的制備：?

分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨激酶、琥珀酸-輔酶A連接酶、輔酶A-谷胱甘肽還原酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、琥珀酰-輔酶A與谷胱甘肽，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/L、0.001-7mol/L、0.1-2mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1-100mmol/L、1-100mmol/L、1-100mmol/L與1-100mmol/L；?

C、待測樣品與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45℃下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制可以不設副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；?

D、在與步驟C)同樣的條件下測定步驟A)標準樣品的吸光度隨時間的變化；?