[發(fā)明專利]豬ERp44基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010583790.2
• 申請(qǐng)日: 2010-12-08
• 公開（公告）號(hào): CN102533753A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊在清;雷霆;龍勤強(qiáng);陳小冬;周磊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/53
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬ERp44基因啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的克隆及功能驗(yàn)證。

背景技術(shù)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白44(ERp44)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)分泌蛋白的正確合成與分泌。ERp44可滯留細(xì)胞內(nèi)的ERO1，影響PDI氧化形成二硫鍵。此外，ERp44還能與免疫球蛋白M亞基、脂聯(lián)素和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)形成二硫鍵，從而調(diào)節(jié)其分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)。ERp44在蛋白質(zhì)的滯留和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的成熟控制中發(fā)揮重要作用，它能與IP₃R₁結(jié)合，調(diào)節(jié)其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的加工和Ca²⁺濃度依賴的分泌調(diào)節(jié)(Higo?et?al.，2005)。脂聯(lián)素是由脂肪組織特異分泌的可調(diào)節(jié)胰島素敏感性和能量代謝平衡的重要脂肪細(xì)胞因子。體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中的脂聯(lián)素以高分子量、低分子量和三聚體等三種主要的形式存在(Sun?et?al.，2009)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，ERp44、ERO1-Lα和GGA能調(diào)控脂聯(lián)素的合成與分泌，而PPARγ激動(dòng)劑能增加脂聯(lián)素的分泌(Wang?et?al.，2007)，這表明ERp44基因可能受到PPARγ的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，但其分子機(jī)制尚不明確。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。提供一種豬ERp44基因(GenBank注冊(cè)號(hào)：NM_001137629)5’上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，確定豬ERp44基因的啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，對(duì)研究ERp44在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其與脂聯(lián)素分泌調(diào)節(jié)的關(guān)聯(lián)具有重要意義，有助于從分子水平闡明脂聯(lián)素的系統(tǒng)生理功能，為治療肥胖和胰島素抵抗提供相關(guān)理論基礎(chǔ)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供含有上述基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的載體。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

申請(qǐng)人通過克隆技術(shù)，從豬基因組獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白ERp44基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示的1～1562位(即豬ERp44基因的-1562～-1位)。

為了獲得本發(fā)明的ERp44基因的表達(dá)調(diào)控元件，對(duì)豬ERp44基因的啟動(dòng)子區(qū)的5’端逐步缺失，插入到pGL3-Basic載體，得到一系列表達(dá)質(zhì)粒，利用螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)這些質(zhì)粒在豬腎細(xì)胞系IBRS2和小鼠成纖維細(xì)胞系NIH/3T3中的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示，在序列表SEQ?ID?NO：1所示序列的246～1091位為主要轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控區(qū)域(即豬ERp44基因的-1317～-472位)。

對(duì)SEQ?ID?NO：1所示序列的246-1091位為主要轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控區(qū)域的序列分析顯示：該取段序列中包含一個(gè)PPRE位點(diǎn)，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示的559～582位的DNA片段(即豬ERp44基因的-1004～-981位)。本發(fā)明針對(duì)該P(yáng)PRE位點(diǎn)進(jìn)行了刪除或突變，檢測(cè)其對(duì)ERp44基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果顯示，上述PPRE位點(diǎn)是PPARγ調(diào)控ERp44基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控元件，PPARγ可與該位點(diǎn)結(jié)合抑制ERp44基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)脂聯(lián)素的分泌。

本發(fā)明首次鑒定了豬ERp44基因啟動(dòng)子關(guān)鍵調(diào)控元件，對(duì)于研究ERp44基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制和脂聯(lián)素分泌調(diào)節(jié)具有重要意義。

附圖說(shuō)明

圖1為豬ERp44基因啟動(dòng)子5’逐步缺失質(zhì)粒在NIH/3T3和IBRS2細(xì)胞內(nèi)的熒光素酶活性分析。圖1中：(A)為豬ERp44基因啟動(dòng)子不同截短的結(jié)構(gòu)示意圖；(B)為豬ERp44基因啟動(dòng)子不同截短的活性分析。熒光素酶載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到NIH/3T3和IBRS2細(xì)胞內(nèi)，pGL3-Basic作為對(duì)照，含有CMV啟動(dòng)子的海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒作為內(nèi)參，反應(yīng)轉(zhuǎn)染的效率；(C)為不同物種ERp44基因啟動(dòng)子內(nèi)保守的PPRE位點(diǎn)分析。結(jié)果顯示，-1317～-472位的啟動(dòng)子截短載體具有最大的啟動(dòng)子活性，而這一個(gè)區(qū)域正好含有推測(cè)的在多物種中高度保守的PPRE結(jié)合位點(diǎn)(-1004～-981)，說(shuō)明PPARγ可能在調(diào)節(jié)ERp44的轉(zhuǎn)錄活性中起作用。

圖2為PPRE位點(diǎn)缺失時(shí)PPARγ對(duì)豬ERp44基因啟動(dòng)子活性的影響。