[發明專利]一種杜氏鹽藻葉綠體轉化載體的構建方法

無效

• 申請號: 201010583119.8
• 申請日: 2010-12-11
• 公開（公告）號: CN102121026A
• 公開（公告）日: 2011-07-13
• 發明（設計）人: 薛樂勛;潘衛東;侯桂琴;李杰;曲東京;賈巖龍
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

技術領域

本發明涉及微藻基因工程，具體是一種杜氏鹽藻葉綠體轉化載體的構建方法，通過構建杜氏鹽藻（以下簡稱鹽藻）葉綠體轉化載體，并且轉化鹽藻，再經同質化篩選，最終實現鹽藻葉綠體轉化。

背景技術

以細胞核為外源基因受體的傳統植物基因工程雖己發展趨于成熟并得到廣泛應用，但隨著研究的不斷深入，人們逐漸認識到對細胞核基因組的遺傳轉化存在一系列難以解決的問題：例如由于細胞核基因組大，背景復雜，外源基因的整合位點和整合的拷貝數難以人為控制，造成外源基因表達效率低，容易出現基因沉默等；同時轉入多個基因時操作步驟過于復雜，所表達的原核基因必須經過修飾改造，環境安全難以保證。

葉綠體轉化系統的出現為克服這些困難提供了一個新途徑。與核基因轉化系統相比，葉綠化轉化系統有以下特點：①基因組小，遺傳背景清晰。目前已有幾十種植物和藻類的葉綠體基因組全序列被測定,這就為外源基因通過同源重組機制定點整合進葉綠體基因組奠定了基礎。定點整合有利于人為控制外源基因的插入位點,可以將目的基因定位在適于表達的位點,能較好地解決“順式失活”、“位置效應”等引起的基因沉默問題,?而且簡化了外源基因轉化后的篩選工作。例如萊茵衣藻的核基因組為10⁵kb，至少有17個連鎖群，上萬個基因，這些基因的結構、功能與序列還不清楚；而葉綠體基因組僅為203kb，除rrn基因和trn基因外編碼大約100個基因，全序列已測定，基因的背景資料非常清楚，葉綠體轉化載體插入的靶序列非常明確，不會影響其它基因的功能。②外源基因超量表達。由于葉綠體中DNA分子有多個拷貝，同時葉綠體在細胞中處于相對隔絕狀態，對表達產物的積累有較強的承受能力,目的基因產物的積累不會對細胞的正常功能產生過大影響,因而為外源基因在葉綠體中的大量表達提供了保障。一系列實驗結果表明葉綠體轉化系統可以使目的基因超量表達，蛋白產量比核基因表達高出20倍以上，甚至高達100-300倍。③基因表達的原核方式。由于葉綠體基因組基因的排列方式、調控方式、ＧＣ堿基對含量及翻譯所偏愛的密碼子與原核生物類似。因此,對來自原核生物的有重要價值的外源基因,無需改造和修飾就可以在葉綠體內高效表達,這是核基因轉化無法做到的。④利于同時進行多基因轉化。在葉綠體基因組中,許多功能相近的基因聚合在一起,共用同一個啟動子,組成多順反子,這種結構為在同一啟動子的調控之下同時表達多個外源基因提供了可行性。許多產品和重要性狀往往是多基因共同作用的產物,僅轉入單個基因難以取得理想效果。核轉化系統轉入多個基因操作復雜,工作量大,而且易出現基因沉默。在葉綠體中表達多個外源基因時可采取“多順反子”原核表達形式,通過一次轉化就可將多個基因引入受體植物,并由共同的啟動子控制,既方便操作又可避免由于存在多個相同啟動子所帶來的“共沉默”。⑤母性遺傳，環境安全性高。

由于葉綠體基因組小，與核基因組相比非編碼區很少，外源片段的隨機插入往往導致自身基因的失活，轉化采用同源重組定點整合的形式，需一定長度的同源片段，通過交換定點整合入葉綠體基因組。因為外源基因的插入位點可控，較少發生基因失活、基因沉默等現象，但因插入位點僅局限于特定的同源區域，使葉綠體基因組轉化效率遠遠低于核基因組，因此同源片段的選擇至關重要，是構建葉綠體轉化載體及成功實現轉化的一個關鍵因素。一般來說需要：①適當的同源片段長度。片段過短同源重組發生率低，但片段過長操作復雜，轉入難度大。實驗證明，兩端同源臂長度均在1?kb-2?kb左右較好；②選擇正確的插入位點，使外源基因的插入不損傷葉綠體功能或者不影響宿主正常生存；由于葉綠體在進化過程中有大規模的遺傳信息轉移或者流失，保留下的幾乎全部是與葉綠體的蛋白合成、DNA復制和光合作用密切相關的重要基因，其破壞將導致細胞的死亡，因此隨機插入對于葉綠體系統是致死性的，合適的插入位點的選擇是葉綠體轉化的第一關鍵點，這也是制約許多植物葉綠體轉化載體構建的一大瓶頸。