[發(fā)明專利]一種高效發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010581033.1
• 申請(qǐng)日: 2010-12-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101984053A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐巖;喻曉蔚;謝甲有
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/20
• 分類號(hào): C12N9/20;C12R1/84
• 代理公司: 北京匯信合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術(shù)領(lǐng)域

一種高效發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法，尤其是一種控制誘導(dǎo)工藝高效發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

脂肪酶(Lipase?E.C.3.1.1.3)全稱Triacylglycerol?acylhydrolase，能夠水解三酰甘油酯為脂肪酸、二酸甘油酯、單酸甘油酯及甘油，其天然底物一般是不溶于水的長(zhǎng)鏈脂肪酸酰基酯，特點(diǎn)是在油水界面起催化作用。因此，脂肪酶可以說(shuō)是專門在異相系統(tǒng)或者非水介質(zhì)中油(或酯)與水的界面上催化的酶。通過(guò)控制反應(yīng)體系中水的含量，改變反應(yīng)條件可以使水解反應(yīng)向合成方向進(jìn)行，這些反應(yīng)通常具有高度的區(qū)域或立體選擇性。自然界中的脂肪酶廣泛地存在于各種生物體中，包括人類和植物。人體和其它動(dòng)物體中，脂肪酶主要功能是對(duì)油脂進(jìn)行消化、吸收和修飾。在植物中，脂肪酶在茉莉酸防疫體系和病原體誘導(dǎo)的水楊酸生成過(guò)程中起重要作用。在微生物中，脂肪酶則是用于對(duì)油脂的水解而生成脂肪酸，脂肪酸再進(jìn)入β-氧化途徑提供能量，并且在微生物油脂的儲(chǔ)存中也起到一定的作用。

微生物脂肪酶種類多，具有比動(dòng)植物脂肪酶更廣的作用pH、作用溫度，并適合于工業(yè)化大生產(chǎn)，所以微生物是脂肪酶的一個(gè)重要來(lái)源，其中根霉屬(Rhizopussp.)微生物是脂肪酶的重要生產(chǎn)菌（Jaeger?K?E?and?Eggert?T.?Curr?Opin?Biotech,?2002,?13:?390-397）。在過(guò)去的十多年里，從根霉菌中分離到超過(guò)30種脂肪酶，多種根霉脂肪酶已被制成商品化酶制劑。各種各樣的微生物，包括細(xì)菌、酵母和霉菌都能用于脂肪酶的生產(chǎn)，并且這些脂肪酶都廣泛用于清潔劑、食品、香料、手性醫(yī)藥中間體、生物材料和一些化學(xué)品的生產(chǎn)中（Hasan?F,?et?al.?Enzyme?and?Microbial?Technol,?2006,?39:235-251）。

然而在脂肪酶生物催化的工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，催化劑脂肪酶是一個(gè)很大的限制因素，自然條件下，菌株產(chǎn)脂肪酶量較低，利用常規(guī)育種方法難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。因此研究人員把注意力集中到克隆和表達(dá)脂肪酶基因上，通過(guò)基因表達(dá)調(diào)控來(lái)提高脂肪酶的活力。

甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母（Pichia?pastoris）作為能夠?qū)崿F(xiàn)外源蛋白高效表達(dá)的優(yōu)秀宿主菌，在學(xué)術(shù)和工業(yè)技術(shù)上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。它具有許多真核表達(dá)系統(tǒng)所特有的特點(diǎn)，如蛋白酶加工，折疊，二硫鍵形成和糖基化作用等（Cereghino?J?L，Cregg?J?M.Heterologous?protein?expression?in?the?methylotrophic?yeast?Pichia?pastoris[J].FEMS?Microbiol?Rev，2000，24:45–66.）。在以AOX酶啟動(dòng)子控制的基因工程菌表達(dá)外源蛋白培養(yǎng)過(guò)程中，甲醇補(bǔ)料策略是一個(gè)非常重要的影響因素。為了避免甲醇積累對(duì)細(xì)胞的毒害作用和對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的不利影響獲得目蛋白的高效表達(dá)，不同甲醇補(bǔ)料策略得到應(yīng)用。Stephan（Stephan?Hellwig，F(xiàn)rank?Emde，Nicole?P?G.Analysis?of?Single-Chain?Antibody?Production?in?Pichia?pastoris?Using?On-Line?Methanol?Control?in?Fed-Batch?and?Mixed-Feed?Fermentations[J].Biotechnology?and?Bioengineering.2001，74:344-352.）等在已建立的畢氏酵母發(fā)酵過(guò)程結(jié)構(gòu)模型基礎(chǔ)上，進(jìn)行了甲醇流加階段恒定比生長(zhǎng)速率。研究發(fā)現(xiàn)在比生長(zhǎng)速率均值相等的情況下，恒定比生長(zhǎng)速率進(jìn)料策略較之恒速進(jìn)料策略蛋白產(chǎn)量高25%。Cunha（Cunha?A?E，Clemente?J?J，Gomes?R，et?al.?Methanol?Induction?Optimization?for?scFv?Antibody?Fragment?Production?inPichia?pastoris[J].?J?Ferm?Bioeng.2003，82:?82-87.）等通過(guò)對(duì)恒定補(bǔ)料速率和變速補(bǔ)料比較發(fā)現(xiàn)恒速補(bǔ)料策略（1.0）更適合外源蛋白表達(dá)。Yu（Xiao-Wei?Yu,?Le-Le?Wang,?Yan?Xu.Rhizopus?chinensis?lipase:?gene?cloning,?expression?in?Pichia?pastoris?and?properties.?(2009)?Journal?of?Molecular?Catalysis?B:?Enzymatic?57:304-311）等通過(guò)甲醇電極恒定控制甲醇濃度來(lái)表達(dá)華根霉脂肪酶，但未能采取其他甲醇流加策略進(jìn)行研究比較。