[發明專利]一種產s-芳樟醇的基因工程菌及其構建方法

無效

• 申請號: 201010579969.0
• 申請日: 2010-12-09
• 公開（公告）號: CN102071155A
• 公開（公告）日: 2011-05-25
• 發明（設計）人: 陳堅;劉繼棟;孫明雪;周景文;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/52;C12P7/02;C12R1/865
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一種產s-芳樟醇的酵母工程菌及其構建方法，尤其是一種分子手段改造萜類生產(MVA)途徑并異源引入s-芳樟醇合成酶，從而調控代謝流實現s-芳樟醇過量積累的方法，屬于遺傳工程領域。

背景技術

芳樟醇(linalool)，又名沉香醇、芫荽醇，學名3,7-二甲基-1,6辛二烯-3-醇。芳樟醇屬鏈狀萜烯醇類，有α-和β-兩種異構體，還有左旋(s)、右旋(l)兩種光異構體。在不同的來源中，多為異構體的混合物。消旋體存在于香紫蘇油、茉莉油中，或是化學合成的芳樟醇中；左旋體s-芳樟醇存在于芳樟油、黃樟油、香檸檬油、薰衣草油、玫瑰木油等精油中。

芳樟醇是重要的香料，用于花香型香精、香水、香皂和芳香工業等，是香水香精、家化產品香精及皂用香精配方中使用頻率最高的香料品種。芳樟醇也是重要的化工原料，如用作維生素E和異植醇的合成前體。目前以松節油合成s-芳樟醇是最主要的生產方式，但存在很多問題，如合成線路長、副產物多且無法控制、有害中間產物殘留等，嚴重影響了其使用的安全性。利用發酵法生產s-芳樟醇和其它單萜類化合物及其衍生物是一種可行的技術思路。萜類化合物的生物合成均來源于共同的前體——異戊二烯焦磷酸(Isopentenyl?pyrophosphate，IPP)。在釀酒酵母中，IPP是由乙酰輔酶A經過甲羥戊酸(MVA)途徑生成的。IPP可以進一步生成香葉基焦磷酸(Geranyl?pyrophosphate，GPP)和法尼基焦磷酸(Farnesyl?pyrophosphate，FPP)等異戊二烯二磷酸同系物，在特定的萜類合成酶和修飾酶作用下，最終形成種類繁多的萜類化合物。

代謝工程改造釀酒酵母生產s-芳樟醇國內未見有相關報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種產s-芳樟醇的基因工程菌通過改造甲羥戊酸(MVA)途徑引入來源于Actinidia?arguta的芳樟醇合成酶，達到異源高效生產s-芳樟醇的目的。

所述酵母工程菌含有s-芳樟醇合成酶基因。

所述s-芳樟醇合成酶基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

所述s-芳樟醇合成酶基因克隆于PRS304。

本發明要解決的另一個技術問題是提供一種產s-芳樟醇的基因工程菌基因工程菌的構建方法。

為解決上述技術問題，本發明的具體方案為：

1）優化genebank?ID:?GQ338153合成s-芳樟醇合成酶基因；

2）將s-芳樟醇合成酶基因與載體連接得到重組表達載體；

3）將重組表達載體轉化釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)后得到基因工程菌。

下面是本發明技術方案的具體描述：

質粒及基因工程菌的構建：

根據NCBI公布的s-芳樟醇合成酶序列，經密碼子優化后，進行全基因合成；將人工合成的s-芳樟醇合成酶基因克隆到整合質粒PRS304(購自德而寶生物技術有限公司，貨號:YV8002）構建整合表達載體；將構建好的表達質粒轉化釀酒酵母CEN.PK2-1C?(MATa;?ura3-52;?trp1-289;?leu2-3,112;?his3D?1;?MAL2-8^C;?SUC2)。PCR?(F1:5’GGACTAGTATTATTCATGGCCAGCTTCAACAGG3’;?

R1:?5’CGGAATTCTATTACAGCATCTTTCGATACATC3’),?驗證陽性轉化子（含有1.9kbp條帶）。

工程菌CEN.PK2?linalool的種子培養及發酵：

種子培養基(g/L)：葡萄糖20?g，1.7?g?YNB和5?g硫酸銨g，亮氨酸0.2g，組氨酸0.2g，尿嘧啶0.2g，pH5.6。在制作斜面和平板時加入20瓊脂，115?°C滅菌20?min。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖20?g，1.7?g?YNB和5?g硫酸銨g，亮氨酸0.4g，組氨酸0.4?g，尿嘧啶0.4g，pH5.6。在制作斜面和平板時加入20瓊脂，115?°C滅菌20?min。