[發明專利]能促進文山紅柱蘭組培苗生長的叢赤殼科屬真菌的分離與應用

有效

• 申請號: 201010577761.5
• 申請日: 2010-12-08
• 公開（公告）號: CN102876580A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 楊根華;李枝林;洪群艷;段春芳;陳思思;董文漢
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;A01H4/00
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 劉明哲

技術領域：

本發明是關于從蘭花根中分離到的菌根菌對文山紅柱蘭組培苗生長有促進作用，屬于植物保護和生物技術領域。?

背景技術：

蘭科(Orchidaceae)植物俗稱蘭花，全世界約有700屬20000多種及大量變種，主要分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區，尤其南美洲和亞洲的熱帶地區為多。蘭科植物根據生長環境的不同可分為地生蘭、附生蘭和腐生蘭3類，作為一種重要的觀賞花卉和藥用植物資源，在花卉和天然藥物產業上有著巨大的經濟價值和利用潛能。隨著中藥現代化和蘭花產業的快速發展，對蘭科植物的需求迅速增長。但蘭科植物種子細小，僅具未分化的原胚；根粗大，根毛不發達。在自然條件下種子不能正常萌發，根也不能滿足植物體對水分和營養物質的需求，使蘭科植物的人工栽培相當困難。近年來，組織快繁技術已應用于蘭科植物，實現了蘭科植物的工廠化育苗，但組培苗移栽成活率很低，生長緩慢，很難大面積推廣，其主要原因在于蘭花在短期內無法與相關的真菌形成菌根，菌根真菌對于蘭科植物有著重要的意義。研究表明，自然狀態下只有真菌與蘭科植物種子或根形成共生的菌根關系后，蘭科植物才能正常地萌發和生長發育。?

菌根是土壤中的一類真菌與植物根系之間所形成的互惠互利的共生聯合體。1885年Frank提出了“菌根(Mycorrhiza)”這一術語來描述植物與真菌的共生聯合體，由此菌根研究開始迅速發展。Link首先證實了蘭科植物根中存在著真菌，之后，蘭科植物與菌根關系得到證實，并進行了廣泛研究。1903年Bernard首次報道了真菌和蘭科植物種子萌發的關系。Burgeff對真菌和蘭科種子研究得出，蘭科種子在真菌的侵染下萌發，他分離并命名了許多真菌，發展了消化真菌作為蘭科植物生長營養來源的重要理論，之后國內外相繼大量開展了蘭科菌根真菌與蘭科植物之間的關系的研究。?

我國蘭科植物菌根菌研究發展很快，天麻菌根菌已經成功地應用于天麻種子萌發和人工栽培。但尚有很多蘭科植物菌根菌需要研究，深入了解共生菌的種類及特點，探討蘭科植物與真菌間的相互作用機制，篩選優良的蘭科植物共生真菌，研制蘭科菌劑，對于實現蘭科植物的工廠化生產具有重要的意義。?

發明內容：

本發明的主要目的是解決蘭科組培苗移栽成活率低，篩選出有利于蘭科植物生長的共生菌。?

本發明采用的真菌是大理片叢赤殼科(Neonectria?macrodidyma?spp.)屬，建議的分類命名：Neonectria?macrodidyma。保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號；保藏日期：2010年06月17日；保藏登記入冊的編號CGMCC?No.3929。?

本發明的真菌菌株叢赤殼科(Neonectria?macrodidyma?spp.)屬菌株，分離自蘭花根內組織，經培養性狀，形態學和分子鑒定，該菌株為叢赤殼科(Neonectria?macrodidyma?spp.)屬。該菌株具有以下特征：(1)該菌株在顯微鏡下可觀察到菌絲無色，多分枝；(2)該菌株能促進蘭花組培苗的生長。?

本發明是這樣實現的：分離蘭花根內真菌，對分離到的真菌進行形態鑒定，并對其進行蘭花組培苗的接種篩選有效共生真菌，對有效菌株進行ITS區段克隆測序。?

本發明叢赤殼科(Neonectria?macrodidyma?spp.)屬的分離鑒定方法：?

1、菌根菌的分離和純化?

PDA固體培養基配方為：20％馬鈴薯，2％葡萄糖，2％瓊脂粉。?

從蘭花植株上取下健壯根段，沖洗干凈，放入燒杯內待用。在進行好滅菌和消毒處理的超凈工作臺上，將燒杯內的根段用70％酒精消毒30s，再用0.1％升汞溶液浸泡1min，最后用無菌水清洗3-5遍。將根切成小片，干燥，放入PDA培養基中。24℃恒溫黑暗培養。當從根段周圍長出菌絲后，挑出菌絲轉移到另一培養皿內，待菌落長成后，重復取菌落邊緣部分進行轉接純化。?

2、分離菌株的形態學鑒定?

將純化后的菌株在25℃的恒溫下培養5-7天，用鑷子或解剖針在菌落邊緣取少量菌絲放在載玻片上，用3％的KOH溶液和0.05％番紅染液染色做成玻片，通過顯微鏡觀察其形態特征，初步鑒定分離菌株所屬。?

3、分離菌株的分子鑒定?

3.1DNA的提取?