[發明專利]利用pRC/CMV-EGFP質粒創制轉綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚方法

無效

• 申請號: 201010577432.0
• 申請日: 2010-12-03
• 公開（公告）號: CN102121032A
• 公開（公告）日: 2011-07-13
• 發明（設計）人: 鐘伯雄;高強;楊國梁;龍勇;危浩;王軍毅;莊蘭芳;葉少群
• 申請（專利權）人: 浙江大學;浙江省淡水水產研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;A01K67/027;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林懷禹

1.一種利用pRC/CMV-EGFP質粒創制轉綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚方法，該方法的步驟如下：

(1)采用分子克隆技術和基因重組的方法，將具有CMV強啟動子的PRC/CMV真核表達載體與EGFP連接構建獲得帶有綠色熒光標記基因的pRC/CMV-EGFP真核表達質粒，pRC/CMV-EGFP質粒包含Amp抗性基因、PCMV啟動子、綠色熒光蛋白標志基因和SV40的多聚腺苷酸識別序列；

(2)采用顯微注射轉基因方法，將pRC/CMV-EGFP質粒導入叉尾斗魚受精卵G₀代，飼養至成魚以交配續代G₁代，在G₁代的胚胎發育至仔魚時期，通過選擇熒光標志基因獲得穩定遺傳的轉基因叉尾斗魚。

2.根據權利要求1所述的一種利用pRC/CMV-EGFP質粒創制轉綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚方法，其特征在于：所述的采用顯微注射轉基因方法的注射時間是產卵后1小時以內、處于單細胞時期的叉尾斗魚受精卵，顯微注射的pRC/CMV-EGFP質?？倽舛仍?0ng/μl～250ng/μl之間，質粒溶解在0.1mM～2mM含有1mM～8mM氯化鈉的磷酸緩沖液中；每粒受精卵注射質粒的總體積在0.5nl～5nl之間。

3.根據權利要求1所述的一種利用pRC/CMV-EGFP質粒創制轉綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚方法，其特征在于：轉綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚的挑選和驗證方法為：通過熒光體視顯微鏡篩選表達綠色熒光蛋白標志的轉基因叉尾斗魚，熒光體視顯微鏡的激發波長為460nm～490nm，發射波長為510nm～550nm。