[發明專利]制備抗藍耳病轉基因豬的方法

有效

• 申請號: 201010576467.2
• 申請日: 2010-12-01
• 公開（公告）號: CN102115731A
• 公開（公告）日: 2011-07-06
• 發明（設計）人: 鮑永華;郭永臣;李秋燕;湯波;李寧
• 申請（專利權）人: 北京濟福霖生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/02;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王加嶺;張慶敏

技術領域

本發明涉及動物轉基因技術，具體涉及一種制備抗藍耳病的轉基因豬的方法。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合癥(Porcine?Reproductive?and?Respiratory?Syndrome，PRRS)，俗稱藍耳病，是由豬繁殖與綜合癥病毒(PRRSV)所引起的一種傳染性疾病。該病于1987年在美國首次發現，2006年我國部分省市豬群暴發高致病性藍耳病，且該病毒與經典的藍耳病病毒相比，基因發生了較大的變異，具有很強的致病性。

在PRRSV的大流行中PRRS造成的經濟損失早已經為人們所熟知。據估計PRRS給美國養豬生產者造成的損失每年達5.6億美元(Cho?and?Dee，2006)。我國是養豬大國，幾乎占世界養豬總量的一半。隨著豬集約化和規模化養殖的發展，豬的傳染性疾病發病率增高，特別是近幾年爆發的“無名高熱病”等帶來的損失都是每年以億元為計算單位，給養豬業帶來巨大損失，極大地挫傷了養豬者的積極性。同時，2007-2008年豬肉價格一漲再漲，以至使豬肉價格創歷史最高記錄，極大地影響了人們生活。

目前在病毒防治中主要采用疫苗，許多學者對PRRS病毒進行了較深入的研究，并在此基礎上研制了弱毒苗、滅活苗和基因工程疫苗，試圖通過免疫途徑控制該病，但是由于藍耳病病毒能導致豬持續感染、病毒血癥及免疫性能低下，至今還沒有能有效地控制PRRS的技術和措施。此外，PRRSV感染可引起機體的細胞免疫功能低下，而體內高水平的病毒特異性抗體又不足以清除病毒，造成病毒在豬體內的持續性感染(Pirzadeh?and?Dea，1998)，這給PRRSV的防治帶來很大的困難，也對現行的免疫策略和疫苗研制手段提出了嚴峻的挑戰。許多國家包括美國已將藍耳病列為危害最大和控制最難的豬傳染病。

RNA干涉(RNAi)是指雙鏈RNA特異性誘導同源靶基因表達沉默的現象，它具有高度特異性，能快速引發轉錄后基因沉默。RNA干涉是由21～23個核苷酸組成的雙鏈RNA引發的，小干涉RNA(siRNA)可以在體外化學合成，也可通過表達載體轉錄而成，它參與降解同源靶基因、抵御病毒入侵、抑制轉座子等，將是基因功能研究、病毒防治、疾病治療和品種改良等的有力工具。

研究證實，RNAi能夠抑制病毒基因的復制、阻止病毒粒子的裝配及影響病毒與宿主之間的相互作用，RNAi用于抗病毒研究的唯一前提是已知病毒基因組序列，且siRNA能快速、高效、特異地降解同源mRNA而不產生任何副作用，從而成為抗病毒感染的有效手段。并在抗病毒研究方面已經取得了顯著成效。

口蹄疫病毒(FMDV)是感染偶蹄動物的危險病毒。Kahana等針對所有FMDV的3個保守區設計了3個特殊的siRNA，細胞結果顯示與對照相比，幾乎顯示了100％的生長抑制作用。Liu等針對FMDV基因組的保守區域5‘NCR，VP4，Vpg，POL，3’NCR設計了siRNA，轉染后12h使BHK221細胞系FMDV的效價下降10倍，1000倍，且這種抑制作用可持續至轉然后第6d。針對FMDV基因組的保守區設計的siRNA能抑制FMDV病毒的復制，是治療高基因變化的FMDV病毒的新策略。

禽流感病毒H5N1已經在人類和禽類中引起了廣泛的呼吸系統疾病，但目前的疫苗免疫和藥物治療都存在局限。Zhou等針對流感病毒基因組的保守區域設計了特異的siRNA(pBabe-NP、pBabe-PA、pBabe-PB1)，受孕雞卵和BALB/c小鼠中顯示了明顯抑制流感病毒的復制增殖。其中pBabe-NP抑制禽流感病毒增殖的特異性最好。RNAi技術提供了預防和治療禽流感病毒在人類和禽類中傳染的方法。

近年來，由虹彩病毒引起的爬行動物、兩棲動物和魚類疾病已在美洲、歐洲、亞洲和澳洲等地普遍流行，真鯛虹彩病毒(RSIV)能引起海洋魚類產生疾病。Dang等構建了靶向RSIV中編碼病毒衣殼蛋白基因(MCP)的siRNA，在轉染感染了病毒的細胞后的84h和94h后，對病毒MCP基因表達的抑制達到55.2％和97.1％。同時，病毒的增殖也被抑制了，表明針對MCP基因的siRNA干擾作用能特異和有效阻止RSIV的復制，是一種潛在的控制病毒感染引起的疾病的方法。顯示了RNAi作為一種基因治療的手段也可用于水生生物的病毒防治。