[發明專利]一種檢測登革1型病毒的熒光定量PCR試劑盒

有效

• 申請號: 201010575216.2
• 申請日: 2010-12-03
• 公開（公告）號: CN102108420A
• 公開（公告）日: 2011-06-29
• 發明（設計）人: 趙衛;熊建英;曹虹;馬丹娟;朱利;萬成松
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市天河廬陽專利事務所 44244
• 代理人: 胡濟元

技術領域

本發明涉及生物化學領域，具體涉及包含核酸、酶或微生物的測定或檢驗方法的檢測試劑。

背景技術

登革病毒屬黃病毒屬，為單股正鏈RNA病毒，可導致登革熱(DF)、登革出血熱(DHF)和登革休克綜合征(DSS)。登革病毒病每年約有5-10千萬人感染，已成為全球公共衛生關注的焦點之一。本病感染潛伏期為2～15天，平均5～6天，通常3～5天，發病前盡管體內有病毒存在，而前驅癥狀卻不明顯。登革熱表現為突然起病，畏寒、迅速發熱等癥狀。登革出血熱有典型登革熱表現，2～4病日內可見散在出血點。病情進展中有鼻腔、牙齦、消化道、泌尿道或子宮等任何一個以上器官的較大量出血，常見肝腫大，腦出血的病例也有發現。異常嚴重出血的病例可導致死亡。登革休克綜合征具有DHF表現的少數病人，在發熱過程中或熱退后，病情突然加重，出現皮膚濕冷、脈數弱、煩燥或昏迷，血壓下降出現休克或脈壓低于2.67Kpa(20mm汞柱以下)等危象，甚至血壓和脈搏測不出，病情兇險，病死率高。

登革熱的診斷目前主要采取病毒分離定型以及血清中特異性IgM、IgG抗體測定的方法。但由于患者早期抗體陽性率低，往往要7-10d后IgM抗體才能達到一個較高的水平，因此在早期診斷中受到一定的限制。近年來發展起來的熒光定量RT-PCR技術可實現早期診斷，而且與常規PCR相比，熒光定量PCR方法更靈敏，且不需要電泳分析，同時因加入特異的熒光標記探針可對PCR擴增產物進行實時檢測，因而更省時、特異，減少了交叉污染，并能精確地對多個樣本進行定量分析。

在以往的研究中有在登革1型病毒3’非編碼區(3’NC)、NS5區、衣殼蛋白(C)區域設計引物探針。目前一般認為3’NC和NS5區設計的引物探針敏感性較差；C區保守性較差，設計出來的引物探針容易受到其它三型登革病毒的干擾；E區變異性很大，會出現假陰性或者敏感性較差。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種登革1型病毒的熒光定量PCR檢測試劑盒，該試劑盒對登革1型病毒具有特異性和敏感性好的優點。

本發明解決上述問題的技術方案具體是：一種檢測登革1型病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒由定量陽性模板、一對特異性擴增登革1型病毒NS2A區域的引物、熒光探針、熒光定量聚合酶Premix?Ex?Taq^TM和參比染料ROX?Reference?Dye?II組成，其特征在于：

(1)所述的引物是特異性擴增登革1型病毒NS2A區域的引物，其中，

上游引物序列為：5’-GATGAGATCCAGATGGAGTAGAAAG-3’(SEQ?NO.1)，

下游引物序列為：5’-TCAGTTGTCCCATTATAAGAAGGAG-3’(SEQ?NO.2)；

(2)所述的熒光探針序列為：

5’FAM-ACAGCCAGTGTTCCAGTCATCAGCA-Eclipse3’(SEQ?NO.3)，

其中FAM為標記在探針5’端的熒光基團，Eclipse為標記在探針3’端的熒光淬滅基團；

(3)所述的定量陽性模板為含有下列DNA片段的pMD18-T重組質粒：

GATGAGATCCAGATGGAGTAGAAAGATGCTGATGACTGGAACACTGGCTGTTTTCCTCCTTCTTATAATGGGACAACTGA(SEQ?NO.4)。

本發明所述的特異性擴增登革1型病毒NS2A區域的引物可以由本領域常用的方法合成。

本發明所述的熒光探針可以由本領域常用的方法合成。

本發明所述的熒光定量聚合酶Premix?Ex?Taq^TM由Takara公司提供、參比染料ROXReference?Dye?II由Takara公司提供。

本發明所述的定量陽性模板的構建方法是將DNA片段SEQ?NO.4插入到質粒載體中構建重組質粒得到。

上述方法中，所述的質粒載體是T克隆載體，如pMD19-T載體；所述的將DNA片段SEQ?NO.4插入到質粒載體的方法為本領域的常規方法，具體的步驟和工藝參數視所選的質粒載體而定。

登革病毒非結構蛋白NS2A可能參與多聚蛋白的水解過程，本發明人通過Clustal?W2對不同株的登革病毒基因進行比對，發現四型登革病毒在NS2A基因處的差別較大，而且與其它黃熱病毒之間也存在很大差別，同時登革1型病毒型內的NS2A基因則比較保守，本發明試劑盒正是通過檢測這段序列來判斷病人是否被登革1型病毒感染，擴增的引物序列為SEQ?NO.1和SEQ?NO.2，其位置如圖1示。