[發明專利]一種甄別李斯特菌的實時熒光PCR檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201010573158.X
• 申請日: 2010-12-03
• 公開（公告）號: CN102010913A
• 公開（公告）日: 2011-04-13
• 發明（設計）人: 金大智;張政;羅蕓;程蘇云
• 申請（專利權）人: 浙江省疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;G01N21/64
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術領域

本發明涉及一種甄別李斯特菌的實時熒光PCR檢測試劑盒及檢測方法。

(二)背景技術

李斯特菌在微生物分類中歸革蘭氏陽性無芽孢桿菌中的位置不定屬，該屬內共有6種菌——單核細胞增生李斯特菌(Listeria?monocytogenes)、伊凡諾夫李斯特菌(Listeria?ivanovii)、無害李斯特菌(Listeria?innocua)、格氏李斯特菌(Listeria?grayi)、斯氏李斯特菌(Listeria?seeligeri)、威爾遜李斯特菌(Listeria?welshimeri)。以前的報道中指出李斯特菌屬中僅單核細胞增生李斯特菌對人有致病性。單核細胞增生李斯特菌廣泛存在于土壤、水、植物、人和動物的糞便中，中毒癥狀嚴重，除了常見的嘔吐、腹瀉等胃腸道表現外，還可以侵蝕人體中樞神經系統(主要表現腦膜炎、敗血癥、流產等疾病)，對機體造成極大地傷害，并且死亡率極高，容易引起李斯特菌病的大暴發。畜禽產品、蛋、乳制品、蔬菜及各種肉類食品是單增李斯特菌主要的污染源。該致病菌還被列為90年代威脅食品安全的四大致病菌(單增李斯特菌，致病性大腸桿菌，肉毒梭菌，親水氣單胞菌)之一。由于單增李斯特菌在4℃的環境中仍能正常生長繁殖，經常污染冷凍食品，因此也是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。但是隨著研究的不但深入，發現該屬內除了單核細胞增生李斯特菌對人致病以外，其他的細菌也對人體致病，其余的5種致病菌均可導致李斯特菌病，同時產生其他臨床癥狀。

目前常規鑒定的鑒定方法中，只有對單增李斯特菌有標準的鑒定方法，而且均是以常規培養方法為主，根據生化特性、致病力及協同溶血試驗等進行鑒定，鑒定周期需要5～10天，而屬內其他致病菌均無標準鑒定方法。

(三)發明內容

本發明目的是根據ssrA基因設計引物，提供一種甄別六種李斯特菌的熒光檢測試劑盒及其檢測方法，可實現對六種李斯特菌快速、準確、特異甄別，使用本發明所述的引物及對應反應體系可以對每種李斯特菌的ssrA基因進行準確分析。

本發明采用的技術方案是：

一種甄別李斯特菌的實時熒光PCR檢測試劑盒，所述試劑盒主要包括特異性引物、Eva?Green熒光染料、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特異性引物和熒光探針序列如下：

上游引物：5′-CGTGCATCGCCCATGTGC-3′

下游引物：5′-ATCTACGAGCGTAGTCAC-3′。

本發明關鍵在于特異性引物的設計和檢測的方法，試劑盒中其他組成，可按本領域常規進行選擇，該試劑盒可用作李斯特菌的定性檢測，也可加入標準品進行定量檢測。

高分辨率熔解曲線技術(High?Resolution?Melting，HR??)技術是近幾年發展起來的高精度分析方法，利用熒光定量PCR技術生成溶解曲線，通過讀取其峰值可以將單個堿基差別的序列進行特異性的鑒定。本發明選取李斯特菌屬特異性基因，可通過熒光定量PCR和HRM技術對屬內的六種致病菌進行準確區分。

進一步，為達到定量檢測的效果，所述試劑盒內還可包括6種李斯特菌的基因標準品，所述標準品序列如下：

單核細胞增生李斯特菌標準品：cgtgcatcgcc?catgtgctac?ggtaagggtc?tcactctaag?tgggctacac?tagttaatct?ccgtctgggg?ttaaatagaa?gagcttaatc?agactagctg?aatggaagcc?tgttaccggg?ccgatgttta?tgcgaaatgc?taatacggtg?actacgctcg?tagat；

伊凡諾夫李斯特菌標準品：cgtgca?tcgcccatgt?gctacggtaa?gggtctcact?ttaagtgggc?tacactaaat?aatctccgtc?tggggttagt?tagaagagct?taatcagact?agctgaatgg?aagcctgtta?ccgggctgat?gtttatgcga?aatgctaata?cggtgactac?gctcgtagat；