[發明專利]一株產精氨酸脫亞胺酶的重組菌的構建及其定向改造方法

有效

• 申請號: 201010572851.5
• 申請日: 2010-12-05
• 公開（公告）號: CN102061283A
• 公開（公告）日: 2011-05-18
• 發明（設計）人: 倪曄;孫志浩;鄭璞
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/55;C12N9/78;C12R1/38
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明包括采用基因工程技術構建精氨酸脫亞胺酶（ADI）重組菌及其定向改造的方法，屬于醫藥生物工程技術領域。

背景技術

精氨酸脫亞胺酶（arginine?deiminase，EC?3.5.3.6，簡稱ADI）是一種極具潛力的用于治療精氨酸缺陷型腫瘤的抗癌新藥，包括目前尚缺乏有效藥物治療的肝細胞瘤（hepatocellular?carcinomas，簡稱HCCs）以及黑素瘤（melanomas）。人們對ADI的抗癌活性的認識始于精氨酸對腫瘤細胞生長所起的重要作用。精氨酸是一種對人類以及鼠的正常細胞都是非基本氨基酸，因為精氨酸可以由瓜氨酸，通過尿素循環的過程中的兩種酶，精氨基琥珀酸合成酶（ASS）和精氨基琥珀酸裂解酶（AL）而生成。但是一些精氨酸缺陷型腫瘤細胞不表達ASS，自身無法合成精氨酸。研究顯示ADI對于精氨酸缺陷型腫瘤，特別是黑素瘤以及肝細胞瘤，具有顯著的抑制作用。

目前，ADI基因已經從細菌和厭氧真核細胞中被分離出來，然而在高等真核細胞中目前還沒有發現有ADI基因和ADI活性的報道。目前，來源于Streptococcus?sanguis、Mycoplasma?arginini、Giardia?intestinals、Pseudomonas?aeruginosa和Lactococcus?lactis的ADI編碼基因被克隆并在大腸桿菌中表達。1966年，Schimke等人發現由支原體Mycoplasma?hominis對腫瘤細胞的抑制作用是通過一種降解精氨酸的酶引起的，這種酶就是ADI。1971年，日本的Kakinoto等人篩選出一株具有很高ADI酶活性的惡臭假單胞菌（Pseudomonas?putida）；并純化得到ADI的蛋白質晶體。但是真正將ADI應用于癌癥治療是最近二十年來才為人們所接受并關注。2002年，Ensor等發現在大腸桿菌中重組表達的支原體ADI對精氨酸營養缺陷型的23種人的黑素瘤以及16種人的肝細胞瘤在體外和體內都具有活性，通過對ADI進行聚乙二醇（PEG）化提高了ADI在體內的半衰期。2004年，他們將ADI-PEG-20用于肝癌的臨床實驗，結果成功使患者血漿中的精氨酸的可檢測濃度降為零。目前，Pheonix?Pharmacologic公司開發的支原體來源的ADI-PEG-20制劑用于肝細胞癌和黑素瘤（藥品名稱分別為Hepacid和Melanocid）的Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗正在美國和意大利進行。

本研究室通過篩選得到一株具有較高ADI活性的變形假單胞菌（P.?plecoglossicida）CGMCC2039，通過PCR擴增獲得該ADI基因（中國專利：200710107822.X）并構建重組菌。研究表明，該重組ADI的最適pH為6.0，生理pH7.4的殘余酶活低于10％，且K_m較高（2.88mmol/L，pH6.0），限制了該重組ADI酶作為抗癌藥物的應用前景。為解決這一問題，本發明對該重組ADI進行定向改造以提高其在生理中性條件pH下的活性并降低其K_m值，采用error-prone?PCR（易錯PCR）突變技術，從P.?plecoglossicida?CGMCC?2039的ADI編碼基因出發，基于改良的二乙酰一肟硫胺脲（測定瓜氨酸）方法，建立了簡便靈敏的96孔板高通量篩選模型。

發明內容

本發明的目的：本發明的目的是采用PCR擴增獲得P.?plecoglossicida?CGMCC?2039的ADI編碼基因，構建重組質粒并于大腸桿菌中表達選取具有改良酶活的ADI突變體，對其進行定向改造。

本發明的技術方案：一種產精氨酸脫亞胺酶的重組菌的構建方法，步驟如下：?

1）由產精氨酸脫亞胺酶ADI的變形假單胞菌（Pseudomonas?plecoglossicida）CGMCC?No.2039，擴增ADI的編碼基因arcA；

2）將arcA基因連接在表達質粒pET24a上，酶切位點為Nde?I及Xho?I，獲得重組質粒pET24a-ADI；

3）將重組質粒pET24a-ADI轉化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得產ADI的大腸桿菌重組菌；該重組菌產生的重組ADI基因全長1254bp，編碼417個氨基酸，蛋白質分子量為92.6kDa，由兩個相同的亞基組成。