[發明專利]農桿菌介導的甜瓜遺傳轉化方法

無效

• 申請號: 201010572321.0
• 申請日: 2010-12-03
• 公開（公告）號: CN102080100A
• 公開（公告）日: 2011-06-01
• 發明（設計）人: 于喜艷;馬樂園;郝慧;單文英;范建光
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及一種高效基因轉化方法。

技術背景

轉基因技術的飛速發展為生物定向改良和分子育種提供了一種較佳的方法，并使其成為基因工程和育種的最有效途徑，目前應用較廣泛的轉基因技術有農桿菌介導法、花粉通道法、顯微注射法、基因槍法、離子束介導法等，其中農桿菌介導法以其費用低、拷貝數低、重復性好、基因沉默現象少、轉育周期短及能轉化較大片段等獨特優點而備受科學工作者的青睞。農桿菌介導法主要以植物的分生組織和生殖器官作為外源基因導入的受體，通過真空滲透法、浸蘸法及注射法等使農桿菌與受體材料接觸，以完成可遺傳細胞的轉化，然后利用組織培養的方法培育出轉基因植株，并通過抗生素篩選和分子檢測鑒定轉基因植株后代。通過基因工程技術將外源基因導入植物細胞是現代遺傳育種的重要途徑，外源基因轉化，整合到受體植物細胞基因組中是植物基因工程的重要環節。但目前研究的瓶頸在于遺傳轉化的效率，因此高效遺傳轉化方法的研究在生物工程領域中尤其重要。

農桿菌是一種革蘭氏陰性土壤桿菌，1970年人們發現它是植物致瘤的起因，它在自然條件下趨化性地感染大多數雙子葉植物的受傷部位，植物細胞被侵染后形成腫瘤，能夠誘發冠癭瘤的稱為根癌農桿菌，誘發毛狀根的稱為發根農桿菌。其中根癌農桿菌在轉基因技術中的應用相對較多。根癌農桿菌的Ti質粒上有一段轉移DNA(T-DNA)，具有向植物細胞傳遞外源基因的能力，而細菌本身并不進入受體細胞。

根癌農桿菌一植物DNA轉移步驟包括：1)植物敏感細胞和根癌農桿菌的相互作用。植物受傷后產生大量對根癌農桿菌感染敏感的細胞。受傷細胞產生一些低分子量的酚類物質可以明顯刺激根癌農桿菌Ti質粒上的Vir區基因表達，其中刺激效果較好的兩種分子為乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮，這兩種化合物是由代謝活躍的受傷細胞特異合成和分泌的。根癌農桿菌染色體上的基因是細菌體內持續表達的基因，大多編碼一些膜相關蛋白，植物受傷后水解生成的單糖與根癌農桿菌相應蛋白結合，使細菌向植物受傷細胞趨化移動。另一些基因編碼的蛋白幫助細菌附著于植物受傷細胞。2)Ti質粒毒性區基因的激活。農桿菌附著到植物受傷細胞后，Vir區基因的激活主要通過VirA-VirG二元調節系統進行。植物分泌的乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮信號分子與VirA蛋白結合并激活VirA蛋白，VirA蛋白又使VirG蛋白磷酸化結構改變而被激活，激活的VirG蛋白對VirG基因本身也有誘導作用，結果產生一種放大式的瀑布效應，然后VirG蛋白與各毒性區5’端非轉錄區的“毒性盒”序列相結合，啟動各毒性區的轉錄。后來人們發現，在缺少乙酰丁香酮的情況下，一些小分子量的糖類，如半乳糖和葡萄糖，也可極大促進Vir區基因的表達。這說明Vir區基因的表達受酚類化合物和糖類的雙重調節。VirH有兩個基因，其編碼的蛋白與細胞色素P450酶相似，可能對植物產生的某些殺菌或抑菌化合物起解毒作用，從而使農桿菌的生長不受這些物質的抑制，可增強附著和致癌能力。3)T-DNA的切割和T-復合體的生成。在Vir區，VirD編碼兩種蛋白VirD1，VirD2。VirD蛋白與T-DNA的加工有關，它決定在邊界重復序列的特定位點上形成切口，產生T鏈斷裂。切割分兩步進行：首先是VirD1與25bp邊界序列親合結合使邊界序列松弛，然后是VirD2在特異位點剪切。VirD2至少有兩個功能，一是特異剪切，并與T鏈5’端共價結合；二是作為核定位信號的導向功能，即引導T鏈進入植物的細胞核。VirC編碼兩種蛋白VirC1及VirC2，VirC1蛋白可特異地與章魚堿型Ti質粒上的超驅動序列結合，從而促進T-DNA邊界序列的缺口剪切。VirC2的功能目前尚不清楚，但VirC2突變能導致缺刻形成的減少，因此它可能也對缺刻形成有一定貢獻。T-DNA鏈必須橫向跨越細菌細胞膜、植物細胞膜及核膜，才能整合進植物基因組。在整個運轉過程中，T-DNA鏈必須被保護形成T-DNA-蛋白復合體才能避免被核酸酶降解。4)T-復合體由根癌農桿菌經細菌細胞膜進入植物細胞膜。經過包被，有了核定位信號，有了助推蛋白T-復合體要實現轉移的第一個關口是細菌細胞膜。這需要形成跨膜通道，需要有跨膜或膜結合蛋白的參與。VirB操縱子的各個基因在T-復合體穿過細菌膜而運轉中起著重要作用。章魚堿型VirB區有11個開放閱讀框架。按功能可將VirB蛋白分成五類：A：在內膜上或內膜內的某些蛋白，可能作為T-復合體的受體。B：蛋白可能作為能源，作為一種ATP酶促使T-復合體被泵出細菌細胞。C：起形成通道的作用。S：載體蛋白，起運載T-復合體穿過通道的作用。P：位于外膜上作為結合植物細胞膜的一種受體。從它們的氨基酸序列推導它們編碼的蛋白質具有穿膜或膜相關蛋白的特性。5)T-DNA整合到植物染色體上。T-DNA整合的過程類似于在哺乳動物細胞中發現的非正常重組。非正常重組包括兩個基本步驟：I.DNA末端的生成；II.DNA末端再連接。DNA非正常重組有幾個特點：a.T-DNA瞄準整合的位點沒有序列特異性。從理論上講，T-DNA整合可以在植物染色體上的任何部位發生，T-DNA整合位點隨機分布于植物基因組。b.整合部位的植物DNA有一小段與T-DNA端點附近區域同源的序列，這種序列一般只需要幾個堿基的長度。C.在重組發生部位可能找到一些額外的核苷酸序列，它們被稱作填充DNA。T-DNA可以一到多拷貝插入植物基因組。