[發明專利]三疣梭子蟹微衛星SSR-15檢測技術

無效

• 申請號: 201010564680.1
• 申請日: 2010-11-24
• 公開（公告）號: CN102041315A
• 公開（公告）日: 2011-05-04
• 發明（設計）人: 陳百堯;于飛;高煥
• 申請（專利權）人: 連云港市海洋與水產科學研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明涉及到一種三疣梭子蟹微衛星位點遺傳多態性的檢測技術，可以應用于三疣梭子蟹遺傳多態性檢測和家系識別等領域，是一種DNA分子標記技術。

背景技術：

DNA分子標記是能夠用來作為指紋鑒定或區分基因組中某種差異特征的DNA片段，這種標記在遺傳學研究和生物技術應用方面越來越成為有用的工具。在基因組水平上，由于DNA上核苷酸堿基的突變造成不同的生物個體之間存在著一定的差別，進而造成許多基因組DNA序列的多態性，即這些序列在不同的個體間是有差別的。分子標記技術就是把這些差別用分子生物學方法表現出來的技術，目前主要有以下幾種分子標記技術：限制性片段長度多態性(Restrictionfragment?length?polymorphism，縮寫RFLP)、微衛星(Microsatellite)或簡單重復序列(Simple?sequence?repeats，縮寫SSR)、隨機擴增多態性DNA(Random?amplifiedpolymorphic?DNA，縮寫RAPD)、擴增片段長度多態性(Amplified?fragment?lengthpolymorphism，縮寫AFLP)、單核苷酸多態性(Single?nucleotide?polymorphism，縮寫SNP)技術等。其中微衛星分子標記技術(Microsatellite)是由串聯重復序列組成，其核心序列為1-6個核苷酸，其中兩堿基重復數目最多。微衛星分子標記技術利用PCR(Polymerase?Chain?Reaction)擴增的原理，在核心重復序列區兩端非重復序列區設計PCR擴增引物，擴增產物經過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，經染色處理后可以顯示出擴增的結果。微衛星廣泛分布于真核生物基因組中，因重復單元數目不同而呈現高度多態性，已成為非常重要的分子遺傳標記之一，具有數量多、分布廣且均勻、多態性豐富、分析快速方便等一系列優點，并具有重要的理論意義和深遠的應用前景。該技術最早于1994年由Zietkiewicz創建。微衛星呈孟德爾共顯性遺傳，可以區別純合顯性個體和雜合顯性個體，是家系或者個體識別以及群體遺傳多態性分析的有用工具。值得一提的是，通常所說的微衛星技術是泛指一切以基因組中核心重復序列區重復序列的多態性為檢測對象的技術，具體到基因組中的各個重復序列區，則每個重復序列所在的序列區被稱為微衛星基因座，針對每個基因座可以開發出相應的微衛星位點檢測技術，本專利所申請的就是這樣一種特定基因座的分析檢測技術。

目前，海洋生物中已經廣泛利用該技術進行了群體遺傳多態性分析、遺傳圖譜構建、系譜認證等工作。在海洋水產生物三疣梭子蟹中的研究起步較晚，開發出來的微衛星數量也較少，但少數開發的幾個微衛星基因座擴增技術都申請了國家發明專利，如“三疣梭子蟹ptssr36微衛星DNA標記的檢測技術”(200810017119)、三疣“梭子蟹ptssr17微衛星DNA標記的檢測技術”(200810017118)。鑒于微衛星分子標記技術在遺傳結構分析中的廣泛用途，開發更多的三疣梭子蟹微衛星基因座分子標記檢測技術具有重要的理論和應用價值。

發明內容：

本發明描述了一個新的三疣梭子蟹微衛星基因座檢測技術，為三疣梭子蟹家系識別和遺傳結構分析提供了一個新的技術，主要內容為通過提取三疣梭子蟹基因組DNA，利用含有重復序列的隨機引物PCR擴增基因組DNA，利用擴增產物建立基因組文庫，對基因組文庫進行測序，查找測序序列中含有微衛星重復序列的片段，以重復序列為核心設計微衛星擴增引物，以PCR、聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色的方法檢測這些引物的擴增結果，從中挑選出一個編號為SSR-15微衛星引物，建立一個適合于三疣梭子蟹家系識別和遺傳結構分析的微衛星基因座檢測技術。

附圖說明：

圖中顯示的編號1-19為來源于不同家系的混合個體，20-25為單一家系的6個個體。微衛星SSR-15在1-25個個體中檢測出來的基因型見表1，其中1-25個個體的編號依次為1-25。在編號1-19個體中，共擴增出385bp、400bp、420bp、430bp、450bp共5個等位基因，在編號20-25的6個單一家系中共擴增出420bp、400bp、385bp三個等位基因，而且這些等位基因在這一單個家系中的分布規律符合來源于同一家系父母本在某一等位基因座的遺傳分離規律，即從中可以推斷出父親或母親的基因型都含有400bp這一等位基因，相應的父本和母本的基因型為400/385和420/400或者420/400和400/385。

具體實施方式：