[發明專利]一種發根農桿菌介導苦瓜發根高頻誘導及遺傳轉化的方法

無效

• 申請號: 201010560912.6
• 申請日: 2010-11-26
• 公開（公告）號: CN101985633A
• 公開（公告）日: 2011-03-16
• 發明（設計）人: 劉仲華;毛清黎;王坤波;楊新河;龔雨順;毛雅慧;李順文
• 申請（專利權）人: 毛清黎
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H5/06
• 代理公司: 武漢凌達知識產權事務所(特殊普通合伙) 42221
• 代理人: 宋國榮

技術領域

本發明屬于植物基因工程及細胞工程技術領域。具體涉及一種發根農桿菌介導苦瓜發根高頻誘導及遺傳轉化的方法。

背景技術

現代研究證實苦瓜皂甙是苦瓜中的主要有效成分，其具有降血糖、抗腫瘤、抗艾滋病、抗氧化、抗生育、抗菌、抗病毒以及提高人體免疫性等藥理作用。與細胞培養和愈傷組織培養相比，發根農桿菌（Agrobacterium?rhizogenes）Ri質粒轉化誘導出的發根具有生長迅速、激素自養、生長條件簡單、次生代謝產物含量高且穩定以及分化程度高、不易變異等特點，此外尚可從發根培養物中尋找新的化合物。因此發根培養技術被認為是一條利用生物技術生產次生代謝產物(如藥物、天然色素、香料、天然調味品等)的新的有效途徑。目前，國內外對苦瓜的有效成分、藥理功能和提取分離技術進行了較全面的研究，但有關利用Ri質粒轉化技術提高苦瓜中功能成分含量及利用苦瓜發根培養技術生產苦瓜中特有功能成分的研究，至今在國內外還沒見相關報道。本發明提供了一種發根農桿菌介導苦瓜發根高頻誘導及遺傳轉化的有效方法，為進一步利用發根培養系統生物合成苦瓜皂甙等有用次生代謝物提供依據。

發明內容

本發明的目的在于提供一種發根農桿菌介導苦瓜發根高頻誘導及遺傳轉化的方法，該方法可獲得較高發根頻率、發根密度和苦瓜總皂甙的苦瓜發根。

本發明提供的技術方案是：一種發根農桿菌介導苦瓜發根高頻誘導及遺傳轉化的方法，選用R1000發根農桿菌（Agrobacterium?rhizogenes）菌株感染苗齡10-20d的苦瓜試管苗的莖段或子葉盤在含IBA5.0的MS培養基中共培養1-2d得到共培養的外植體，然后在含500?mgL^-1頭孢霉素的1/2MS0固體培養基上脫菌培養8-10d便可獲得苦瓜發根。

所述的苗齡10-20d的苦瓜試管苗由下法得到：取苦瓜種子剝出種皮，用蒸餾水浸泡1h，在75％乙醇中浸泡1min，用無菌水沖凈乙醇，再用0.1％HgCl₂消毒10min，無菌水沖洗5次，置于MS0培養基上12h/d光照培養至苗高6-8cm。

所述的感染是指：從YEB斜面培養基挑取發根農桿菌單菌落，轉至含100mgL^-1卡那霉素的YEB培養液，于黑暗、25℃，120?rpm培養24～36?h得發根農桿菌菌液；將苦瓜無菌苗的莖段或子葉盤浸入發根農桿菌菌液中，浸泡10-20min取出；用無菌濾紙吸干多余的菌液。

所述的脫菌培養是指：共培養的外植體經無菌水沖洗4-5次，無菌濾紙吸取表水后移至含500?mgL^-1頭孢霉素的1/2MS0固體培養基上培養，25℃，在黑暗條件下脫菌培養，2-5d轉接一次，直到無菌斑。

采用本發明獲得的苦瓜發根，發根頻率及發根密度最高可達84.2%和12.3，發根中苦瓜總皂甙含量達33.43?mg/g，分別比苦瓜試管苗的根、莖和子葉含量高69.1%、48.6%和49.8%。?本發明利用Ri質粒轉化苦瓜成功，這為選育優質高產的苦瓜新品種以及利用Ri質粒為載體,進行有用基因轉移奠定了基礎，也為利用苦瓜發根培養生物合成苦瓜皂甙等藥用成分提供了有效途徑。?

具體實施方式???

試管苗培養：取苦瓜種子(青皮苦瓜和長白苦瓜種子)剝出種皮，用蒸餾水浸泡1h，在75％乙醇中浸泡1min，用無菌水沖凈乙醇，再用0.1％HgCl₂消毒10min，無菌水沖洗5次，置于MS0培養基上12h/d光照培養至苗高6-8cm左右（約1-3w）可作為供轉化的外植體材料。?

菌種的活化：從YEB斜面培養基挑取R1000發根農桿菌（Agrobacterium?rhizogenes）單菌落，轉至含100mgL^-1卡那霉素的YEB培養液（25-30ml/100ml三角瓶），于黑暗、25℃，120?rpm培養24~36?h（菌液OD₆₀₀=0.8-1.0，相當于8X10⁶-10⁷個細菌/ml菌液）用于感染。?

外植體的轉化：

浸染：將苦瓜無菌苗外植體（切成10mm左右的莖段或5*5mm²子葉盤）浸入經活化的發根農桿菌菌液中，浸泡10-20min取出。用無菌濾紙吸干多余的菌液。?